蝎毒BmBKTx1結(jié)構(gòu)與功能的研究前體蛋白加工酶furin的研究.pdf

1、本論文主要涉及三個(gè)方面的工作。第一部分：蝎毒BmBKTx1雙功能面的研究；第二部分：前體蛋白加工酶furin在胞內(nèi)定位的研究：第三部分：基于組蛋白H1.2片段的furin抑制劑的研究。 1.蝎毒BmBKTx1雙功能面的研究 在漫長的3.5億年的生存選擇中，蝎子逐漸進(jìn)化出了形形色色，功能各異的神經(jīng)活性多肽，這些多肽是它們進(jìn)攻與防御的主要武器，大多作用于各類Na+和K+通道。鉀離子通道是生物體中最基礎(chǔ)的功能蛋白之一，對鉀離子

2、有高度離子選擇通透性，在生理的變化過程中起著重要的作用。目前，蝎活性多肽已經(jīng)成為研究K+通道的藥理，生理，結(jié)構(gòu)和功能特性的最有力的工具。BmBKTx1是從東亞馬氏鉗蝎中純化到的一個(gè)新型短鏈毒素。它由31個(gè)氨基酸殘基組成，含3對二硫鍵，與SK(低電導(dǎo)鈣激活型鉀通道)毒素的一級結(jié)構(gòu)比較相似，但僅僅具有比較弱的SK阻斷活性。實(shí)驗(yàn)表明BmBKTx1對高電導(dǎo)鈣激活型鉀通道(BK)有明顯的抑制作用，同時(shí)它不具有對電壓門控型鉀通道(Kv)的抑制活力。

3、BmBKTx1是第一個(gè)報(bào)道的能同時(shí)作用于BK和SK的蝎毒素，它具有一定的昆蟲選擇性，也是第一個(gè)能作用于果蠅BK通道(dSlo)的蝎毒素。 BmBKTx1是第一個(gè)被確認(rèn)的能夠同時(shí)作用于BK通道和SK通道的蝎毒素。它有可能是通過兩個(gè)不同的功能面來作用于這兩個(gè)通道。為了證明這個(gè)假設(shè)，本文在大腸桿菌中重組表達(dá)了BmBKTx1的野生型和它的兩個(gè)突變體，K21A-Y30A和R9A-K11A，并測定了它們對蟑螂的BK通道(pSlo)和大鼠的

4、SK2通道的阻斷活性。結(jié)果表明突變體K21A-Y30A對BK通道的阻斷活性有著明顯的降低，但是對SK通道的阻斷活性沒有變化。而突變體R9A-K11A對BK通道和SK通道的阻斷活性均沒有變化。這些結(jié)果證實(shí)了BmBKTx1具有雙功能面的假設(shè)，并且確認(rèn)了它的BK功能面位于毒素C端的β折疊上。這些結(jié)果可以促進(jìn)BmBKTx1在BK通道疾病的治療，搜尋鉀通道毒素，以及殺蟲劑等方面的應(yīng)用開發(fā)。 2. Mint3與furin相互作用調(diào)控了fur

5、in在高爾基體上的定位 多肽或蛋白質(zhì)以前體形式合成后，需要前體蛋白加工酶的剪切才能獲得完全的生物活性。這些前體蛋白加工酶成為生物體內(nèi)重要的生理病理過程的調(diào)控者。Furin是發(fā)現(xiàn)得最早且功能研究最為清楚的哺乳動物前體加工酶，許多重要的生理過程需要furin的參與，如多肽與蛋白質(zhì)激素的合成與分泌、膜受體的成熟、血漿蛋白前體的激活等；同時(shí)多種疾病的發(fā)生也與furin密切相關(guān)，如病毒外殼蛋白和細(xì)菌外毒素的加工活化以及腫瘤的轉(zhuǎn)移等。現(xiàn)階段

6、雖然對furin的細(xì)胞內(nèi)定位和自身加工成熟有較多研究，但很多具體機(jī)制和細(xì)節(jié)并不清楚。因此，對furin相互作用蛋白質(zhì)的鑒定和功能分析不僅具有重要的理論意義，也有利于開發(fā)抗病毒和抗細(xì)菌外毒素的先導(dǎo)藥物。 前體加工酶furin在細(xì)胞內(nèi)分泌后，在質(zhì)膜，內(nèi)吞體和高爾基體(TGN)之間循環(huán)，主要分布于高爾基體。Mint3是Mint接頭蛋白家族的成員，可以調(diào)控膜蛋白的運(yùn)輸和分泌。迄今為止，對于在furin的運(yùn)輸和定位過程中，mint3所起的

7、作用仍然了解得很少。本文通過免疫共沉淀和免疫熒光共定位的實(shí)驗(yàn)，證明了mint3和furin可以相互作用，并且它們在HeLa細(xì)胞里共定位于高爾基體。通過RNA干擾的方法下調(diào)內(nèi)源mint3的表達(dá)之后，furin的高爾基體定位被破壞，同時(shí)增加了其在內(nèi)吞體中的分布。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明mint3通過PTB結(jié)構(gòu)域(phosphotyrosine binding domain)與furin相結(jié)合，并調(diào)控了furin在高爾基體上的定位。此外，對furin

8、進(jìn)行突變發(fā)現(xiàn)，mint3主要通過和furin的酸性多肽信號區(qū)相互作用來調(diào)節(jié)furin的分布。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果第一次發(fā)現(xiàn)，mint3通過PTB結(jié)構(gòu)域與furin的酸性多肽信號區(qū)相互作用調(diào)控了furin在高爾基體上的特異性定位。這些結(jié)果闡明了一條新的furin在細(xì)胞內(nèi)定位和轉(zhuǎn)運(yùn)的途徑，提供了furin相關(guān)疾病的新的藥物靶點(diǎn)，有利于治療學(xué)方面的發(fā)展。 3.基于組蛋白H1.2片段的furin抑制劑的設(shè)計(jì)改造 在哺乳動物的許多生理和

9、病理活動中，前體加工酶furin起到了非常重要的作用，例如對病毒糖蛋白和細(xì)菌毒素的激活。尋找小分子量，無毒性，高活力的furin抑制劑是解決該類疾病的非常有吸引力的藥物設(shè)計(jì)途徑。本文根據(jù)furin的抑制劑histone H1.2的C端片段設(shè)計(jì)和合成了一系列的短肽抑制劑。將抑制劑的活性位點(diǎn)替換成為furin的最佳底物識別位點(diǎn)，可以極大地增強(qiáng)抑制劑的抑制活性。在所設(shè)計(jì)的短肽抑制劑中，抑制活力最好的是一條14肽的抑制劑，對furin的抑制常數(shù)