家蠶Serpin家族蛋白酶抑制劑的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、蛋白酶抑制劑的主要功能是抑制蛋白酶活性，廣泛分布于動(dòng)物、植物、真菌、細(xì)菌和病毒等生物體內(nèi)。在蛋白酶抑制劑中分布最多，研究最為廣泛的就是絲氨酸蛋白酶抑制劑（serine protease inhibitors，SPIs），該類蛋白酶抑制劑主要調(diào)節(jié)蛋白酶的水解級(jí)聯(lián)過程，調(diào)控動(dòng)物、昆蟲體內(nèi)凝血、炎癥反應(yīng)、彈性蛋白修復(fù)、組織分化和凋亡等過程;在植物中，絲氨酸蛋白酶抑制劑還可以防御昆蟲和病原菌的侵害，調(diào)控逆境中蛋白酶的過度水解破壞，以及在增加抗蟲

2、性等都起到了重要作用。絲氨酸蛋白酶按照作用機(jī)理可以分為三類:典型、非典型和serpin。典型絲氨酸蛋白酶采取傳統(tǒng)的鎖鑰模型結(jié)合底物，而serpin類抑制劑則是通過活性中心環(huán)狀區(qū)（reactive centre loop）與底物以牢固的共價(jià)結(jié)合方式形成復(fù)合體，產(chǎn)生不可逆的抑制效果。
　　本文的研究中將模式生物家蠶作為主要研究對(duì)象。研究表明，絲氨酸蛋白酶抑制劑通過精確的調(diào)控蛋白酶水解，參與家蠶的生長、發(fā)育、蛻皮和變態(tài)等生長發(fā)育過程，并

3、且與抵御病原微生物入侵響應(yīng)過程密切相關(guān)。但是已有研究的serpin類蛋白酶抑制劑集中在脂肪體、絲腺、消化系統(tǒng)、體液和繭殼中，對(duì)于體壁中的研究較少，不僅如此，現(xiàn)有的研究報(bào)道集中在蛋白酶抑制劑的分離和鑒定階段，對(duì)于很多重要的serpin類蛋白酶抑制劑的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系尚不明了。在家蠶的免疫防御過程中，病原微生物主要通過分泌胰蛋白酶等酶類水解穿透體壁。所以本文對(duì)家蠶體壁中的胰蛋白酶抑制劑做了詳細(xì)的研究，并且對(duì)SW-AT-1的結(jié)構(gòu)與功能間的

4、關(guān)系做了詳細(xì)闡述。
　　本文建立了以硫酸銨沉淀和Trypsin inhibitor Sepharose4B親和層析為主要步驟的純化方法，從P50品系的體壁總蛋白中部分純化了胰蛋白酶抑制劑(trypsin inhibitors，TIs)。通過明膠活性電泳技術(shù)，在分離膠上觀察到具有胰蛋白酶抑制性的條帶在12條以上，與體液中的活性分離結(jié)果相比，體壁中的胰蛋白酶抑制劑分布較少，其主要不同活性位置在膠上分離出4個(gè)條帶，分別在70 kDa、3

5、5-45 kDa和25 kDa附近;在熱穩(wěn)定性研究中，家蠶體壁中的胰蛋白酶抑制劑活性條帶在60℃以上開始減少和變淡，說明其熱穩(wěn)定性不高;僅有兩個(gè)分子量在18-25 kDa間的活性條帶表現(xiàn)出了極強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，甚至在100℃處理后，仍然可以保持一定活性。酸堿穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中觀察到體壁中的所有胰蛋白酶抑制劑活性條帶變化差異微小，說明這些TIs可以在酸性(pH3)或弱堿(pH10)環(huán)境中保持穩(wěn)定的活性，具有一定的酸堿穩(wěn)定性。
　　將部分純化后

6、的SDS-PAGE和活性電泳結(jié)果對(duì)照，選擇純化后分離蛋白濃度較高，在活性膠檢測(cè)中表現(xiàn)出強(qiáng)抑制活性的3條膠條，并且這三個(gè)膠條對(duì)應(yīng)蛋白酶抑制劑都是體壁中特有的。切下酶解后進(jìn)行MALDI-TOF-MASS質(zhì)譜鑒定，收集到大量的肽段質(zhì)量指紋譜數(shù)據(jù)(PMF)，通過在Mascot的UniProt數(shù)據(jù)庫中檢索找到對(duì)應(yīng)PMF信息的蛋白。鑒定出三個(gè)抑制劑相關(guān)蛋白，分別是silkworm antitrypsin isoform1(SW-AT-1)、類絲氨酸

7、蛋白酶抑制劑和一個(gè)肽酶，UniProt登陸號(hào)分別為:C7ASM9、Q1HPQ5和D2KMR2，理論分子量分別為43428.4 Da、43345.43 Da和77611.43 Da，等電點(diǎn)分別為5.41、5.19和6.37。通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)silkworm antitrypsinisoform1屬于serpin家族;Q1HPQ5則是一種具有特定水解活性位點(diǎn)，在部分水解后才能激活的胰蛋白酶抑制劑前體。下一步的研究旨在對(duì)鑒定的蛋白酶抑

8、制劑的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系探究，所以我們選擇將SW-AT-1和Q1HPQ5進(jìn)行基因克隆，并通過構(gòu)建原核重組載體，進(jìn)行體外重組表達(dá)。對(duì)表達(dá)后的重組蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)與功能研究。
　　將已獲得的蛋白質(zhì)氨基酸序列通過NCBI的Protein BLAST，找到和SW-AT-1和Q1HPQ5相對(duì)應(yīng)的編碼mRNA全序列，GenBank登陸號(hào)分別為:FJ613793和NM_001046997.2。已有報(bào)道表明SWAT基因有10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子，其中9個(gè)

9、外顯子分別構(gòu)成4個(gè)選擇性拼接選擇性拼接異構(gòu)體，分別為SW-AT-1、SW-AT-2、SW-AT-3和SW-AT-4，已有文獻(xiàn)報(bào)道SW-AT-1在體內(nèi)表達(dá)量最高，并主要存在于體壁中，這四個(gè)選擇性拼接異構(gòu)體基因的堿基差異對(duì)位于mRNA序列的1200-1210 bp的位置，也是成熟肽編碼區(qū)域的末端。通過氨基酸序列對(duì)比，確定從體壁中分離純化得到的鑒定蛋白就是SW-AT-1，所以選擇SW-AT-1的CDS區(qū)域作為基因克隆的模版。在目的片段的PCR

10、擴(kuò)增和測(cè)序結(jié)果中只檢測(cè)到SW-AT-1基因，而未檢測(cè)到其他的三個(gè)選擇性拼接異構(gòu)體基因。該基因CDS區(qū)含有1310個(gè)核苷酸，共編碼392個(gè)氨基酸，實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)的特異引物切除了信號(hào)肽編碼區(qū)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析也表明SW-AT-1含有典型的serpin家族抑制劑的結(jié)構(gòu)域。實(shí)驗(yàn)中通過菌液PCR、雙酶切驗(yàn)證和DNA序列測(cè)序驗(yàn)證原核重組pET-28a-SW-AT-1的構(gòu)建成功。將重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌C43表達(dá)菌株進(jìn)行原核表達(dá)，結(jié)果顯示SW-AT-1存在破

11、碎菌體的上清液中，而Q1HPQ5則形成無活性的包涵體沉淀，無法進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
　　將大腸桿菌C43中表達(dá)的重組蛋白利用Ni-NTA親和層析法純化，并洗脫出大量的純化蛋白。在測(cè)定純化的SW-AT-1重組蛋白抑制活性中，首次發(fā)現(xiàn)SW-AT-1還具有胰蛋白酶抑制功能。其胰蛋白酶活性熱變性溫度在47-50℃之間，熱穩(wěn)定性不高，與之前的明膠活性電泳結(jié)果相符;其酸堿穩(wěn)定性則相對(duì)較高，在pH3-pH10之間活性很穩(wěn)定，在強(qiáng)酸或堿性環(huán)境中無活性

12、。對(duì)胰凝乳蛋白酶的抑制活性測(cè)定后，SW-AT-1均表現(xiàn)出同樣的穩(wěn)定性。接著通過抑制劑常數(shù)的確定，分析表明SW-AT-1對(duì)兩種蛋白酶的親和力極高，Ki值分別為為1.73×10-10 M和0.86×10-10 M，與胰凝乳蛋白酶的結(jié)合力力更強(qiáng)，在酶的動(dòng)力學(xué)作用關(guān)系上表現(xiàn)為競爭性抑制。
　　通過3D建模對(duì)SW-AT-1的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬，結(jié)構(gòu)模擬采取基于SWISS-MODEL服務(wù)器的同源預(yù)測(cè)方法，蛋白模板為煙草天蛾serpin1K復(fù)合體

13、(PDB序號(hào):1SEK)，Procheck和Verify3D的模型評(píng)估結(jié)果均證明模擬結(jié)構(gòu)正確、可靠。接著在NCBI的保守結(jié)構(gòu)與分析中，再次確定RCL區(qū)域的結(jié)構(gòu)模擬可靠性，三維模擬結(jié)構(gòu)表明確定的氨基酸位點(diǎn)G327，A328，E329和A330位于RCL的N-端，F(xiàn)352，N353，A354，N355，K356和P357位于RCL的C-段，對(duì)應(yīng)上述10個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)氨基酸殘基替換的突變實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建出10個(gè)突變體G327A、A328G、E329

14、G、A330G、F352A、N353D、A354G、N355S、K356G和P357G。采取同樣的步驟進(jìn)行原核表達(dá)和純化，獲得的純化蛋白和野生型進(jìn)行圓二性色譜分析，結(jié)果顯示野生型二級(jí)結(jié)構(gòu)中:α螺旋占33％，β折疊占16％;野生型SW-AT在不同溫度和pH中的活性變化與三級(jí)結(jié)構(gòu)的圓二色性圖譜變化呈現(xiàn)一致性，而二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化則無對(duì)應(yīng)性，所以SW-AT-1的三級(jí)結(jié)構(gòu)決定了其抑制功能。在3D模擬結(jié)構(gòu)中，RCL是SW-AT-1結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)凸出暴

15、露區(qū)域，該區(qū)域是控制SW-AT-1功能的關(guān)鍵區(qū)域;并且在突變體的活性檢測(cè)和圓二色性圖譜中，突變體G327A和E329G均表現(xiàn)出抑制活性的劇烈降低以及二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)的明顯變化，證明G327和E329氨基酸殘基是RCL正確折疊與否的關(guān)鍵位點(diǎn);除此之外，突變體K356G則表現(xiàn)出活性的明顯升高和三級(jí)結(jié)構(gòu)變化，以及三級(jí)結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性提高，證明在RCL區(qū)域的近C-端區(qū)域，將末端位點(diǎn)替換為較小的氨基酸殘基，可以增加RCL與蛋白酶底物的結(jié)合能力，并增加