前體mRNA剪接蛋白ZNF265的表達(dá)、調(diào)控及功能研究.pdf

1、鋅指蛋白ZNF265(ZNF265，Zfp265，zis)于1997年由Karginova等人從大鼠的JG細(xì)胞(renaljuxtaglomerular)中克隆到[1]。JG細(xì)胞是位于腎動(dòng)脈和腎小球緊密連接處的一類特化的肌內(nèi)皮細(xì)胞，其主要功能是合成，分泌與儲(chǔ)存腎素(renin)。作為腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)中的重要活性物質(zhì)，腎素對(duì)于血管內(nèi)血壓及鹽離子濃度的維持十分重要，然而關(guān)于JG細(xì)胞維持分化狀態(tài)分泌腎素的分子機(jī)制卻鮮有報(bào)導(dǎo)。ZN

2、F265的mRNA存在于分化狀態(tài)的具有分泌腎素功能的JG細(xì)胞中，但在非分化狀態(tài)并且無分泌腎素功能的JG細(xì)胞中其表達(dá)消失。因此，ZNF265可能與JG細(xì)胞的分化狀態(tài)和腎素分泌的功能相關(guān)[1-3]。對(duì)ZNF265編碼的序列分析表明，ZNF265具有兩個(gè)新型的鋅指結(jié)構(gòu)，一個(gè)Ser-Are(SR)富集區(qū)，一個(gè)谷氨酸富集區(qū)和一個(gè)核定位信號(hào)(NLS)(圖1)，這些特征可能與前體mRNA剪接或成熟mRNA結(jié)合相關(guān)[4]。2001年，Adams等人的研

3、究發(fā)現(xiàn)，隨著轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)的ZNF265表達(dá)質(zhì)粒濃度的遞增，ZNF265可以促使Tra-2β1前體mRNA第二、三個(gè)外顯子的選擇性剔除，導(dǎo)致截短型Tra-2β3剪接體增加[5]。因此，ZNF265可能是一個(gè)參與選擇性剪接的多功能蛋白，包括通過直接調(diào)節(jié)腎素前體mRNA的后加工過程或者通過對(duì)其他基因的調(diào)控間接影響JG細(xì)胞分化狀態(tài)。 Fig．1 Amino acid sequence of ZNF265-1 and box diagra

4、m of motifs and domains本文的主要目的是檢測(cè)ZNF265在細(xì)胞、組織中的表達(dá)及ZNF265在具有局部腎素-血管緊張素的組織中的表達(dá)調(diào)控，研究ZNF265對(duì)于腎素及其它相關(guān)基因前體mRNA剪接影響并探索ZNF265在JG細(xì)胞的去分化過程中的功能。 首先我們通過RT-PCR等方法分析了ZNF265在人及小鼠各個(gè)組織中的表達(dá)譜，在小鼠的組織里，發(fā)現(xiàn)并克隆了ZNF265的一個(gè)新的亞型mZNF265-2，它在人體當(dāng)中

5、具有高度同源的對(duì)應(yīng)體hZNF265-2。對(duì)ZNY265在不同組織的表達(dá)量的分析表明，ZNF265的兩個(gè)亞型在人體及小鼠的各個(gè)組織當(dāng)中均有表達(dá)，在20周的人胎組織中，ZNF265-1及ZNF265-2普遍表達(dá)，但表達(dá)水平隨組織不同而有差異，如在大腦、小腦和肝組織中，兩個(gè)亞型的轉(zhuǎn)錄體表達(dá)量基本相當(dāng)(ZNF265-1/ZNF265-2的比值在0.9～1.1之間)。在心、肺、腸組織中，ZNF265-2的表達(dá)明顯高于ZNF265-1的表達(dá)(ZNF

6、265-1/ZNF265-2的比值在0.45～0.7之間)；而在腎組織中，ZNF265-1的表達(dá)明顯高于ZNF265-2的表達(dá)(ZNF265-1/ZNF265.2的比值為1.48)。相比之下，在小鼠的各個(gè)組織當(dāng)中都以ZNF265-1的表達(dá)方式為主，且ZNF265-1相對(duì)與ZNF265-2的表達(dá)比例差異不大，大體為4：1左右。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，ZNF265 mRNA的表達(dá)與所在組織的特異性密切相關(guān)，相對(duì)于小鼠，ZNF265 mRNA在人體當(dāng)中

7、的表達(dá)可能受到更復(fù)雜的調(diào)控。 為了分析ZNF265在人及小鼠不同組織中的蛋白表達(dá)，我們首先針對(duì)ZNF265及其兩個(gè)亞型制備了特異的抗血清并通過ELISA、GST融合蛋白原核表達(dá)等實(shí)驗(yàn)鑒定這些抗血清的特異性。Western blot結(jié)果顯示，ZNF265-1蛋白在受檢的人及小鼠各個(gè)組織中均有表達(dá)，并且在小鼠不同發(fā)育階段具有不同的表達(dá)特征：初生小鼠各個(gè)組織ZNF265蛋白表達(dá)差異較小，而在成年小鼠中，ZNF265在腎、肺和心肌組織中

8、表達(dá)量較高，在腦、肝等組織中的表達(dá)量較低。此外，在受檢的人胎兒及小鼠組織中，我們沒有檢測(cè)到ZNF265-2蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，在人類及小鼠組織中以ZNF265-1蛋白表達(dá)為主，ZNF265-2可能僅作為轉(zhuǎn)錄體存在并不表達(dá)蛋白，或表達(dá)量低于可檢測(cè)范圍。 作為一個(gè)參與選擇性剪接的SR相關(guān)蛋白，ZNF265主要功能場(chǎng)所應(yīng)該在細(xì)胞核內(nèi)。用制備的兔抗ZNF265抗血清及Histag抗體，我們檢測(cè)了內(nèi)源性ZNF265蛋白及過表達(dá)ZNF

9、265融合Histag蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，并觀察了GFP融合ZNF265蛋白在COS1細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)分布。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，ZNF265主要在細(xì)胞核內(nèi)分布，也驗(yàn)證了我們制備的兔抗ZNF265抗血清能用于免疫組化的檢測(cè)。 由于ZNF265可能與腎素分泌相關(guān)，本文檢測(cè)了ZNF265在具有局部腎素-血管緊張素的小鼠生殖系統(tǒng)內(nèi)的表達(dá)分布及所受調(diào)控。通過免疫組織化學(xué)、精子免疫細(xì)胞化學(xué)等的方法對(duì)ZNF265在生殖系統(tǒng)中的分布進(jìn)行檢測(cè)，研究結(jié)

10、果表明，ZNF265蛋白特異性地分布在雌鼠卵巢的透明帶，黃體和髓質(zhì)細(xì)胞的核內(nèi)，雄鼠精子尾部的中段和附睪主細(xì)胞近腔面的緊密連接處。這些分布與腎素-血管緊張素系統(tǒng)中的血管緊張素Ⅱ的表達(dá)分布具有相似性[6-8]。另外，以正常小鼠為對(duì)照，在去勢(shì)小鼠內(nèi)的附睪中，ZNF265表達(dá)大大降低，而補(bǔ)加了睪酮后，ZNF265的表達(dá)恢復(fù)到正常水平。這一調(diào)控現(xiàn)象，和已報(bào)道的血管緊張素及其受體在附睪內(nèi)的調(diào)控表達(dá)具有類似性[9]。研究結(jié)果提示，ZNF265可能參與

11、了對(duì)腎素-血管緊張素系統(tǒng)中相關(guān)基因的調(diào)節(jié)，此可能性尚有待進(jìn)一步研究。 相關(guān)報(bào)導(dǎo)表明，腎素在人體內(nèi)有多個(gè)選擇性剪接產(chǎn)物，分別為分泌型的腎型(Renin a)和不分泌型的腦型(Renin b)及肺型(Renin c)成熟轉(zhuǎn)錄體[10,11]。作為前體mRNA的選擇性剪接蛋白ZNF265，有可能通過對(duì)腎素前體mRNA的選擇性剪接調(diào)控而參與調(diào)節(jié)腎素表達(dá)。因此我們構(gòu)建了腎素小基因(Renin Exon1-3)用于研究ZNF265是否對(duì)其具

12、有選擇性剪接的功能。其中外顯子Renin Exon1a和Renin Exon1c的選擇性剪接為二者取一的模式，分別只存在于腎型和肺型的成熟轉(zhuǎn)錄體中。通過對(duì)腎素小基因剪接模型的研究表明，腎素小基因在體內(nèi)的選擇性剪接模式和細(xì)胞類型相關(guān)，ZNF265過量表達(dá)對(duì)腎素前體mRNA剪接模式?jīng)]有影響。說明腎素的表達(dá)具有復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，與決定細(xì)胞類型的多種蛋白的綜合作用相關(guān)。 考慮到ZNF265在體內(nèi)各個(gè)組織中均有表達(dá)，可能具有廣泛作用。本文還

13、構(gòu)建了FGF-2R、GluR-B、hZis、mZis等小基因，并研究了ZNF265對(duì)SMN2、CFTR等疾病相關(guān)基因的選擇性剪接的影響，其中FGF-2R、GluR-B為神經(jīng)系統(tǒng)特異表達(dá)基因；SMN2和CFTR在體內(nèi)廣泛表達(dá)，SMN2外顯子7的選擇性剃除與脊髓性肌萎縮癥(spinal muscular atrophy，SMA)臨床表型的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，CFTR的成熟轉(zhuǎn)錄體缺少Exon9會(huì)引起先天性雙側(cè)輸精管缺失(Congenital b

14、ilateral absence of the vas deferens，CBAVD)；hZis、mZis小基因則包含了人或小鼠ZNF265的9～11外顯子的基因組DNA片段，用于研究ZNF265的自調(diào)控功能。研究結(jié)果表明，ZNF265的過量表達(dá)對(duì)于FGF-2R前體mRNA剪接沒有明顯影響。對(duì)于GluR-B、SMN2、CFTR等小基因，ZNF265的過量表達(dá)分別能促進(jìn)GluR-B外顯子14、SMN2外顯子7和CFFR外顯子9的選擇性剃除

15、，即促進(jìn)它們的前體mRNA的截短型剪接并且這些截短型剪接產(chǎn)物的比例增加為ZNF265蛋白濃度依賴型。此外，我們的研究發(fā)現(xiàn)，ZNF265-2的過量表達(dá)可改變對(duì)hZis、mZis小基因的剪接方式，提示該剪接蛋白可能參與對(duì)自身前體mRNA的剪接調(diào)控。 鑒于ZNF265具有典型的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以前的研究認(rèn)為ZNF265可能與成熟mRNA結(jié)合。若ZNF265和JG細(xì)胞分化狀態(tài)及腎素-血管緊張素系統(tǒng)的相關(guān)基因有表達(dá)調(diào)控的關(guān)系的話，ZNF

16、265有可能通過與目標(biāo)基因的mRNA結(jié)合調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)。鑒于諸多研究表明細(xì)胞周期蛋白調(diào)節(jié)因子和細(xì)胞分化狀態(tài)有密切關(guān)系，本文用免疫共沉淀結(jié)合RT-PCR的方法不僅篩選了與ZNF265蛋白可能相結(jié)合的腎素-血管緊張素系統(tǒng)的相關(guān)基因的mRNA還篩選了與ZNF265蛋白可能相結(jié)合的多種細(xì)胞周期蛋白調(diào)節(jié)因子的mRNA。我們的研究表明，雖然ZNF265蛋白與腎素-血管緊張素系統(tǒng)的相關(guān)基因的mRNA沒有直接結(jié)合的關(guān)系，但和細(xì)胞周期蛋白調(diào)節(jié)因子Cy

17、clin B1、Cyclin D2的mRNA具有明顯的結(jié)合關(guān)系，提示ZNF265對(duì)于細(xì)胞周期蛋白調(diào)節(jié)因子B1、D2的表達(dá)有調(diào)控關(guān)系。有證據(jù)表明，ZNF265蛋白家族的C4SR(爪蟾源)及Zfp265(大鼠源)在體外能和Cyclin B1轉(zhuǎn)錄體結(jié)合，這與我們的研究結(jié)果是一致的。細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白Cyclin B1和Cyclin D2與細(xì)胞的生長(zhǎng)及分裂密切相關(guān)，在很多癌細(xì)胞和去分化細(xì)胞中都會(huì)過表達(dá)[12-16]。因此ZNF265很可能通過參與

18、對(duì)這些細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白mRNA穩(wěn)定性或后加工等過程的調(diào)節(jié)而影響了JG細(xì)胞的去分化過程。 綜上所述，本論文圍繞ZNF265在前體mRNA剪接中的功能和機(jī)制這一大方向，進(jìn)行了初步的探索，對(duì)ZNF265的亞型，發(fā)育調(diào)控，在細(xì)胞及組織內(nèi)的表達(dá)，在具有局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)內(nèi)受到的調(diào)控，在前體mRNA選擇性剪接中的功能及作用的下游基因進(jìn)行了研究。研究結(jié)果提示，作為一個(gè)有多個(gè)功能域的鋅指蛋白，ZNF265對(duì)于基因的選擇性剪接、細(xì)胞的分化及