原蛋白轉(zhuǎn)化酶furin P1啟動(dòng)區(qū)SNP分布及其對(duì)轉(zhuǎn)錄活性的影響研究.pdf

1、[背景]： 目前全球近三分之一的人口感染了或感染過HBV，其中慢性HBV感染者約為3.5億。HBV感染的自然史極為復(fù)雜，從自限感染到慢性感染，從急性肝炎到慢性肝炎，嚴(yán)重者尚可出現(xiàn)肝衰竭、肝硬化和肝細(xì)胞癌。在一定程度上，這種懸殊的預(yù)后差異受到宿主遺傳因素的影響，其中單核苷酸多態(tài)性(SNP)是其重要的物質(zhì)基礎(chǔ)，如啟動(dòng)區(qū)的SNP可影響下游基因的表達(dá)水平等。肝細(xì)胞分泌通路上的furin，一種原蛋白轉(zhuǎn)化酶，參與了HBeAg形成，其相應(yīng)基因

2、Fur(gene ID5045)的啟動(dòng)區(qū)存在一些SNPs。它們可能通過影響Fur活性而影響HBeAg分泌，并最終影響到HBV感染的轉(zhuǎn)歸。furin基因具有三個(gè)啟動(dòng)子：P1，P1A，P1B，在肝細(xì)胞中，P1啟動(dòng)子對(duì)基因轉(zhuǎn)錄起主要作用。前期臨床研究(由課題組中的雷瑞祥老師完成)顯示：Fur P1啟動(dòng)區(qū)SNP—229(C/T)的T等位基因和TT基因型與HBV持續(xù)感染有關(guān)，提示該SNP可能影響Fur表達(dá)水平和furin活性，支持furin在HB

3、V感染發(fā)生發(fā)展中起重要作用，值得進(jìn)行深入研究。 [目的]： (1)調(diào)查南中國健康人furin基因P1啟動(dòng)區(qū)SNPs的分布狀況，分析各SNP的基因型和分布頻率，明確有無新的SNP出現(xiàn)。 (2)根據(jù)SNP分析結(jié)果，進(jìn)一步對(duì)SNP功能進(jìn)行研究，分析不同SNP基因型轉(zhuǎn)錄活性的差異，明確SNP對(duì)furin基因表達(dá)水平的影響，為闡明furin在HBV感染發(fā)生發(fā)展中的作用，以及furin作為治療新靶點(diǎn)等深入研究提供理論基礎(chǔ)。

4、 [材料和方法]： 1.收集和整理furin基因信息和序列，通過Gen—Bank數(shù)據(jù)庫獲得furin P1啟動(dòng)區(qū)的序列，從NCBI主頁(http：//www．ncbi．nlm．nih．gov)的LocusLink選項(xiàng)進(jìn)入dbSNP數(shù)據(jù)庫(http：//www．ncbi．nlm．nih．gov/SNP/)查閱furin基因P1啟動(dòng)區(qū)相關(guān)的SNP信息。 2.收集84例健康人(無HBV感染者)的全血樣本，提取全基因組DN

5、A進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR引物設(shè)計(jì)覆蓋Fur P1啟動(dòng)區(qū)約1100堿基，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳切膠回收純化后直接測(cè)序，讀解序列，分析南中國Fur P1啟動(dòng)區(qū)SNP基因型和頻率，并尋找新的SNP位點(diǎn)。 3.選取—229位點(diǎn)分別為CC基因型和TT基因型的樣本，經(jīng)PCR擴(kuò)增純化1100bp片段克隆到pGL3-basic載體，構(gòu)建成pGL—229C、pGL—229T重組體，采用測(cè)序法驗(yàn)證重組體序列的正確性。 4.將構(gòu)建的重組體使用Fu

6、geneHD分別轉(zhuǎn)染HuH7，HepG2，Hela3種細(xì)胞，收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行雙熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)，數(shù)據(jù)使用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用兩樣本均數(shù)t檢驗(yàn)。 5.以pCMV—F為模板(含F(xiàn)ur完整cDNA，由Dr．G．Thomas惠贈(zèng))，PCR擴(kuò)增furin基因cDNA片段，分別插入pGL—229C、pGL—229T(P1啟動(dòng)區(qū)片段與報(bào)告基因之間)構(gòu)建pGL—229C—F、pGL—229T—F，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染H

7、epG2細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)furin mRNA表達(dá)，設(shè)轉(zhuǎn)染空pGL—3質(zhì)粒為對(duì)照。 [結(jié)果]： 1.在furin基因P1啟動(dòng)區(qū)1100bp的范圍內(nèi)已登記了6個(gè)SNP，最常見的是rs4912378和rs34397663，其中rs4912378(位置—229C/T)在GeneBank中的基因分布頻率分別為C/C0.689；C/T0.289；T/T0.022。其它SNP在人群中的分布情況無深入研究。 2.在南中國

8、84例健康人中，P1啟動(dòng)區(qū)1110bp范圍內(nèi)僅發(fā)現(xiàn)兩個(gè)SNP位點(diǎn)，即—229(C/D)和—660(—/A)，其中—229C和T等位基因頻率分別為80.9％(136/168)和19.1％(32/168)，CC、CT和TT基因型頻率分別為67.9％(57/84)，26.2％(22/84)和5.9％(5/84)，符合Hardy—Weinberg分布，且與dbSNP數(shù)據(jù)庫中報(bào)道的分布頻率類似。 3.雙熒光報(bào)告系統(tǒng)分析表明，對(duì)比pGL—2

9、29C，pGL—229T重組體的熒光相對(duì)比值在HepG2，HuH7，Hela3種細(xì)胞中分別高出2.97倍，3.02倍，3.23倍。 4.轉(zhuǎn)染pGL—229C—F、pGL—229T—F組furin mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高，且pGL—229T—F組是pGL—229C—F組的1.5-2.3倍，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析具有顯著性差異。 [結(jié)論]： 1.在南中國健康人中，F(xiàn)ur P1啟動(dòng)區(qū)主要的SNP位點(diǎn)為—229(C/T)。