廣西眼鏡蛇蛇毒神經(jīng)生長因子的分離純化及NGF基因的真核表達.pdf

1、目的：從廣西眼鏡蛇蛇毒中分離純化神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)，并測定其純度和活性；克隆編碼成熟NGF的cDNA序列，構(gòu)建其真核表達載體pcDNA3,1(-)-NGF，并在哺乳動物細胞NIH3T3中進行表達。 方法：采用Sephadex G-75柱層析和CM Sepharose CL-6B陽離子交換柱層析從廣西眼鏡蛇蛇毒中分離純化神經(jīng)生長因子，洗脫峰各管對抗NGF抗體進行雙向免疫擴散，收集免疫反應(yīng)

2、陽性峰。用SDS-PAGE、PC12細胞分別進行純度鑒定和活性測定。 用Trizol試劑從眼鏡蛇毒腺中提取總RNA，采用RT-PCR的方法逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，并根據(jù)廣西眼鏡蛇cDNA序列和表達載體的特征設(shè)計和合成上下游引物，進行PCR擴增；將目的基因、真核表達載體pcDNA3,1(-)分別經(jīng)Kpn I和Xho I單酶切，酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳并分別進行膠回收；將目的基因與載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH16B從而構(gòu)建重組載體

3、pcDNA3,1(-)-NGF，經(jīng)酶切和測序?qū)χ亟M體進行鑒定。利用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000方法轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞，對陽性克隆培養(yǎng)上清中NGF的表達用SDS-PAGE、Western-Blot的方法來檢測。 結(jié)果：通過凝膠排阻色譜和陽離子交換柱層析，得到兩個主要樣品，分子量分別為13KD和23KD，用PC12細胞測定兩樣品均有NGF活性。 重組載體pcDNA3,1(-)-NGF經(jīng)酶切、測序分析，插入的