眼鏡蛇毒素NatratoxinⅡ的結(jié)構(gòu)功能研究.pdf

1、蛋白酶類（如磷脂酶A2、類凝血酶、金屬蛋白酶等）在蛇毒中廣泛存在，它們具有豐富生物學功能。其中蛇毒PLA2能夠水解甘油磷脂，其機制主要是使底物的sn-2位的酯鍵斷裂，從而產(chǎn)生產(chǎn)物溶血磷脂和脂肪酸。它的生物學功能根據(jù)近年來的研究主要有水腫活性、抗凝血活性和肌肉毒性等，這使得其在藥理學上具有廣泛的應用。
　　 中華眼睛蛇粗毒經(jīng)過兩步層析法得到NatratoxinⅡ蛋白。肽指紋譜分析表明，NatratoxinⅡ?qū)儆谒嵝訮LA2。對Na

2、tratoxinⅡ的酶學特性進行表征，NatratoxinⅡ具有較高的酶學活性，比同類型的酸性PLA2的活性高，在35-40℃及pH7.5-8.0條件下具有最高酶活。同時，利用不同的二價金屬離子替換反應體系里的Ca2+證明了Ca2+離子是PLA2發(fā)揮磷脂水解活性所必須的。
　　 以往的研究表明，蛇毒中的某些蛋白成分可以通過作用于血管平滑肌細胞上的離子通道，進而影響血管的收縮和舒張。在本研究中，血管環(huán)張力實驗表明，Natratox

3、inⅡ可以使收縮的血管進一步收縮。利用特異性阻斷劑進行阻斷實驗發(fā)現(xiàn)TEA能完全阻斷NatratoxinⅡ的血管收縮活性，說明NatratoxinⅡ作用于平滑肌細胞膜上大電導鈣激活鉀通道(BKCa)。
　　 因為沒有獲得質(zhì)量較好的晶體衍射數(shù)據(jù)，所以并沒有得到NatratoxinⅡ的三維結(jié)構(gòu)。但是NatratoxinⅡ與之前報道的Natratoxin兩者在一級序列上只有六個氨基酸殘基的差別。這六個氨基酸殘基都位于蛋白質(zhì)表面，對蛋白質(zhì)

4、的整體結(jié)構(gòu)影響不大，因此我們直接采用用Natratoxin的晶體結(jié)構(gòu)對NatratoxinⅡ的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系進行分析。通過Natratoxin和NatratoxinⅡ兩者結(jié)構(gòu)的對比分析，我們推測:雖然在NatratoxinⅡ中三個連續(xù)的Asn氨基酸的突變(T106N、D107N、A108N)在結(jié)構(gòu)上產(chǎn)生的影響非常微小，但是少量電荷性質(zhì)的改變卻直接改變了NatratoxinⅡ結(jié)合通道的類型。
　　 綜上，在本文中，我們從中華眼睛蛇毒

5、中分離得到了一個蛇毒PLA2家族的蛋白NatratoxinⅡ。對其功能進行研究發(fā)現(xiàn)，此蛋白能作用于平滑肌細胞上的BKCa通道。其收縮血管環(huán)的活性較本課題組分離的其它PLA2家族蛋白的收縮活性要高。對此蛋白的研究將為蛇毒PLA2的應用提供新的途徑。
　　 另外，我們還解析了重組蛋白Y2與α-Chymotrypsin復合物的晶體結(jié)構(gòu)并詳細分析了Y2與α-Chymotrypsin的結(jié)合界面。結(jié)果表明，Y2主要通過Arg16/Lys17