眼鏡蛇毒神經(jīng)生長因子的提取及抗PC12細胞凋亡的研究.pdf

1、目的:阿爾茨海默病(AD)是神經(jīng)系統(tǒng)常見的以認知障礙為特征的退行性疾病，以基底前腦膽堿能神經(jīng)元的退變?yōu)橹饕牟±硖卣髦?。?淀粉樣蛋白(Aβ)是腦內(nèi)細胞外老年斑的主要成份，其通過凋亡途徑致細胞死亡在AD的神經(jīng)元丟失中起重要作用。神經(jīng)生長因子(NGF)為膽堿能神經(jīng)元的重要營養(yǎng)因子，動物實驗和體外細胞培養(yǎng)提示NGF能有效保護膽堿能神經(jīng)元受損傷導(dǎo)致的神經(jīng)變性，使NGF的潛在藥物作用備受矚目。NGF主要通過其高親和性酪氨酸蛋白激酶受體TrkA

2、介導(dǎo)其信號，與磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-K)/蛋白激酶B(PKB，Akt)途徑、Ras-絲裂原激活蛋白激酶(MAPK，ERK)途徑間相互聯(lián)系。該文旨在通過以β-淀粉樣蛋白毒性片斷Aβ<,25-35>誘導(dǎo)大鼠嗜鉻瘤細胞株P(guān)C12細胞凋亡建立體外AD細胞模型，研究從眼鏡蛇毒分離的NGF是否有抗β-淀粉樣蛋白致凋亡的作用并探討可能的機制。通過應(yīng)用TrkA受體信號通路激酶的特異阻斷劑、檢測caspase-3的活性及Bcl-2表達的變化，著重探

3、討NGF抗β-淀粉樣蛋白致PC12細胞凋亡作用的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，為闡明AD的發(fā)病機理及其預(yù)防和治療提供實驗依據(jù)。 方法: (1)應(yīng)用Sephadex-G50凝膠層析、CM-Sepharose FF陽離子交換層析及Sephacryl S-200 High Resolution柱層析從中華眼鏡蛇粗毒中分離純化NGF，以PC12細胞生物活力測定為跟蹤檢測手段；應(yīng)用SDS-PAGE和IEF-PAGE分別測定純化NGF的分子量和

4、等電點。 (2)應(yīng)用PC12細胞建立β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的細胞凋亡模型，以熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，DNA凝膠電泳，四唑氮藍(MTT)法，乳酸脫氫酶(LDH)釋放法，流式細胞術(shù)等檢測凝聚態(tài)β-淀粉樣蛋白毒性片斷Aβ<,25-35>誘導(dǎo)的PC12凋亡，同時檢測蛇毒NGF干預(yù)下細胞的凋亡變化。 (3)P13-K/Akt、Ras/細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)途徑是NGF受體后細胞增殖和分化調(diào)控的基本信號傳導(dǎo)通路。為明

5、確P13-K/Akt、Ras/ERK是否參與NGF受體介導(dǎo)的抗β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)PC12細胞凋亡的作用，Western-blot法檢測NGF作用的PC12細胞胞漿的Akt、ERK1/2磷酸化活性變化，并應(yīng)用PI3-K的特異抑制劑LY294002和ERK1/2的特異抑制劑PD98059分別調(diào)控其活性，流式細胞儀等觀察應(yīng)用抑制劑后對PC12細胞暴露Aβ<,25-35>及NGF干預(yù)的細胞凋亡的變化，同時以Western-blot法測定細胞Bc

6、l-2表達和caspase-3活性的變化。 結(jié)論: (1)建立簡單的分離方法，從眼鏡蛇粗毒中分離獲得電泳純NGF，生物學(xué)活性良好，有利于正確評價天然來源NGF的作用。 (2)凝聚態(tài)Aβ<,25-35>對PC12細胞具有毒性作用，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、DNA梯帶電泳、流式細胞儀等分析，顯示20μmol/L Aβ<,25-35>能有效建立PC12細胞凋亡模型。 (3)蛇毒來源的NGF有部分對抗Aβ<,25-35>致P

7、C12細胞凋亡的作用。 (4)眼鏡蛇毒來源的NGF抗Aβ<,25-35>誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡的作用與PI3K/Akt途徑相關(guān)，通過激活P13K—→激活A(yù)kt—→上調(diào)Bcl-2的表達—→降低caspase-3激活—→抑制細胞凋亡。 (5)本實驗結(jié)果顯示蛇毒來源的NGF抗Aβ<,25-35>誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡的作用與ERK途徑間未見明顯相關(guān)，抑制ERK1/2的活性，對細胞的凋亡無明顯影響。 綜上所述，眼鏡蛇毒來