舟山眼鏡蛇毒細(xì)胞毒素CTXn的分離純化及其鎮(zhèn)痛作用研究.pdf

1、背景：蛇毒是由多種蛋白質(zhì)、多肽、酶類和其他小分子物質(zhì)組成的混合物。細(xì)胞毒素（cytotoxins，CTXs）和神經(jīng)毒素(neurotoxin，NT)和PLA2是其主要毒性成分。細(xì)胞毒素由60--63個(gè)氨基酸組成，空間結(jié)構(gòu)呈三指結(jié)構(gòu)，因其分子中由致密的內(nèi)核伸展出3個(gè)指狀肽鏈環(huán)而得名。蛇毒的成分復(fù)雜多樣，種屬之間變異很大。同一種屬，由于性別、年齡、或地域的不同，成分也會(huì)有所差別.Mukherjee AK[6]研究發(fā)現(xiàn)，印度相鄰三個(gè)地區(qū)的同種

2、眼鏡蛇毒，排除年齡，性別，季節(jié)的影響，其成分和生物活性仍存在很大差別。舟山眼鏡蛇主要分布于華南，臺(tái)灣、越南北部和老撾北部地區(qū)，明確其成分的地域性差異，對(duì)蛇毒的分離純化和蛇傷急救有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
　　 神經(jīng)病理性疼痛常由外周或中樞的神經(jīng)損傷或功能紊亂引起。臨床主要表現(xiàn)為：痛反應(yīng)增強(qiáng)（hyperalgesia)、痛閾下降(allodynia)和自發(fā)性疼痛(spontaneous pain)。目前臨床上對(duì)神經(jīng)病理性疼痛還缺乏有效的藥物

3、治療，常用的鎮(zhèn)痛藥物主要是NSAIDs和阿片類藥物，但藥效的局限和不可避免的副作用限制了其應(yīng)用。因此，有必要尋找和開(kāi)發(fā)新的有效減緩神經(jīng)病理性疼痛的藥物。外周神經(jīng)損傷的動(dòng)物模型如，SNI,CCI,SNL等，能夠模擬神經(jīng)病理性疼痛的一些癥狀，對(duì)研究神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制和藥物開(kāi)發(fā)提供了工具和載體。
　　 蛇毒鎮(zhèn)痛的研究與應(yīng)用已有很久的歷史。在上世紀(jì)初，已有報(bào)道從眼鏡蛇毒中分離出的神經(jīng)毒素cobrotoxin具有鎮(zhèn)痛作用。從響尾蛇毒中分

4、離出的crotalphine，通過(guò)κ-opioid受體，對(duì)CCI模型引起的痛敏，痛超敏和自發(fā)痛具有抑制作用。從響尾蛇毒中分離出的crotoxin，通過(guò)中樞煙堿受體和5-HT受體，對(duì)坐骨神經(jīng)瘤疼痛模型引起的神經(jīng)病理性疼痛具有鎮(zhèn)痛作用。細(xì)胞毒素的作用，則主要集中在心臟毒性，細(xì)胞凋亡，抗腫瘤，細(xì)胞毒性和抗血小板聚集。近期Dexian Donga和Jiang WJ報(bào)道了細(xì)胞毒素的鎮(zhèn)痛作用。相對(duì)于神經(jīng)毒素，細(xì)胞毒素由于其低毒性，顯示了廣闊的應(yīng)用前

5、景。研究細(xì)胞毒素的鎮(zhèn)痛及其作用機(jī)制已成為蛇毒鎮(zhèn)痛研究的新的方向。本實(shí)驗(yàn)擬探討蛇毒細(xì)胞毒素CTXn的鎮(zhèn)痛作用，為鎮(zhèn)痛藥物開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)支持。
　　 目的：運(yùn)用RP-HPLC比較大陸中南地區(qū)六省區(qū)的舟山眼鏡蛇毒的成分差異，選取CTX含量豐富的江西宜春地區(qū)的舟山眼鏡蛇蛇毒進(jìn)行分離純化和鎮(zhèn)痛組分初篩。經(jīng)過(guò)生化鑒定后，運(yùn)用急性疼痛模型和神經(jīng)病理性疼痛模型進(jìn)行鎮(zhèn)痛作用的評(píng)價(jià)，同時(shí)運(yùn)用微透析聯(lián)合RP-HPLC技術(shù)對(duì)其鎮(zhèn)痛作用機(jī)制作一初步探討。<

6、br>　　 方法：
　　 一、舟山眼鏡蛇毒細(xì)胞毒素的分離純化及鑒定
　　 1.中南地區(qū)蛇毒樣品的RP-HPLC分析
　　 收集中南地區(qū)六個(gè)省區(qū)的舟山眼鏡蛇毒樣本，經(jīng)采集處理后，運(yùn)用RP-HPLC技術(shù)進(jìn)行蛇毒成分的含量的地域性差異分析。
　　 2.舟山眼鏡蛇毒的分離純化及成分鑒定
　　 舟山眼鏡蛇蛇毒的分離純化采用Sephadex G-75層析和離子交換層析兩步法進(jìn)行。將分離后的蛇毒各組分進(jìn)行鎮(zhèn)痛

7、作用初篩。選取有效成分作進(jìn)一步純度分析和MALDI-TOF質(zhì)譜及蛋白質(zhì)序列測(cè)定。
　　 二．CTXn的毒性及鎮(zhèn)痛活性測(cè)定
　　 1.毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)
　　 Bliss法檢測(cè)其LD50毒性，運(yùn)用藥物耐受性模型、間接 ELISA 檢測(cè)和條件性位置偏愛(ài)(CPP）實(shí)驗(yàn)、大鼠催促戒斷實(shí)驗(yàn)和自然戒斷實(shí)驗(yàn)測(cè)定CTXn的藥物耐受性和依賴性。
　　 2.急性疼痛實(shí)驗(yàn)
　　 運(yùn)用熱板實(shí)驗(yàn)和醋酸扭體實(shí)驗(yàn)測(cè)定CTXn對(duì)生理性疼

8、痛的鎮(zhèn)痛作用。
　　 3.神經(jīng)病理性疼痛實(shí)驗(yàn)
　　 運(yùn)用大鼠脊神經(jīng)結(jié)扎(SNL)模型測(cè)定CTXn對(duì)機(jī)械刺激痛敏和熱刺激痛敏的抑制作用；并用非特異性阿片受體拮抗劑納洛酮和膽堿能受體拮抗劑阿托品測(cè)定其對(duì)CTXn鎮(zhèn)痛作用的影響。
　　 4.動(dòng)物自主活動(dòng)測(cè)試曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)
　　 檢測(cè)CTXn對(duì)動(dòng)物自主活動(dòng)的影響。
　　 三．微透析技術(shù)檢測(cè)CTXn對(duì)脊髓水平單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)控
　　 1.采用脊髓微透析技

9、術(shù)聯(lián)合HPLC-ECD技術(shù)
　　 實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)采集脊髓背角部位的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素(NA)和5-羥色胺（5-HT）進(jìn)行定量分析，測(cè)定其NA和5-HT的含量變化及CTXn對(duì)其含量的影響。
　　 2.測(cè)定納洛酮和阿托品干預(yù)對(duì)CTXn引起NA和5-HT含量變化的影響。
　　 四．統(tǒng)計(jì)分析
　　 采用t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)，SPSS軟件等統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　 結(jié)果：
　　 1.運(yùn)用RP-HPLC

10、比較中南六省區(qū)的舟山眼鏡蛇毒成分差別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各地蛇毒樣品中所含主要成分相同，但各成分的含量存在很大差異。CTXn在江西宜春地區(qū)的含量最高，在廣西元寶山地區(qū)則沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這種成分。
　　 2.運(yùn)用Sephadex G-75層析和離子交換層析兩步法對(duì)舟山眼鏡蛇蛇毒進(jìn)行分離純化。分離效果良好，分離組分的純度可達(dá)95％以上。
　　 3.蛇毒成分的鎮(zhèn)痛初篩和理化性質(zhì)鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所分離出的成分中，CTXn的鎮(zhèn)痛效果較好，治療指數(shù)高。

11、
　　 4.CTXn的小鼠腹腔注射的LD50為19.61±2.05mg/kg.CTXn長(zhǎng)期腹腔給藥易導(dǎo)致藥物耐受，腹腔給藥期間ELISA檢測(cè)有抗體產(chǎn)生。CTXn鞘內(nèi)給藥不存在藥物耐受。條件性位置偏愛(ài)(CPP）實(shí)驗(yàn)、大鼠催促戒斷實(shí)驗(yàn)和自然戒斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明長(zhǎng)期給予CTXn不會(huì)產(chǎn)生藥物依賴性。
　　 5.熱板實(shí)驗(yàn)和醋酸扭體實(shí)驗(yàn)測(cè)定，不同劑量的CTXn(0.50mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg.ip.)對(duì)生理性疼痛

12、有良好鎮(zhèn)痛作用，且具劑量依賴性。
　　 6.神經(jīng)病理性疼痛實(shí)驗(yàn)測(cè)定，CTXn（0.50mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg.ip.）對(duì)SNL引起的機(jī)械刺激痛敏和熱刺激痛敏有抑制作用；其鎮(zhèn)痛作用可被納洛酮翻轉(zhuǎn)，但阿托品對(duì)此無(wú)影響。
　　 7.曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)劑量的CTXn對(duì)動(dòng)物自主活動(dòng)無(wú)影響。
　　 8.脊髓微透析聯(lián)合HPLC-ECD技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CTXn可促進(jìn)SNL模型動(dòng)物脊髓背角去甲腎上腺素

13、(NA)和5-羥色胺（5-HT）的分泌增加。納洛酮可逆轉(zhuǎn)此作用。
　　 結(jié)論：
　　 1.中南六省區(qū)的舟山眼鏡蛇毒成分存在地域性差異。地域相近的蛇毒成分含量較為接近。
　　 2.運(yùn)用Sephadex G-75層析和離子交換層析兩步法分離純化眼鏡蛇蛇毒，分離效果好，純度高。
　　 3.CTXn長(zhǎng)期系統(tǒng)給藥，易導(dǎo)致藥物耐受，可能與抗體的產(chǎn)生及中和作用有關(guān)。CTXn長(zhǎng)期應(yīng)用不會(huì)產(chǎn)生依賴性。
　　 4.C