小型豬乳牙和恒牙牙髓干細胞生物學特性及其體內成骨的研究.pdf

1、干細胞是機體各種組織細胞的最初來源，具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能，目前，已廣泛用于組織工程學中培育新的組織和器官。牙髓組織是一種胚胎性的疏松結締組織，富含成體干細胞。2000年，Groynthos等從人第三磨牙牙髓分離出具有克隆源性的多潛能細胞，稱為恒牙牙髓干細胞DPSCs(dentalpulp stem cells，簡稱DPSCs)<'[1]>。2003年，NIH施松濤教授發(fā)現(xiàn)兒童脫落乳牙的牙髓內也含有具有多向分化潛能的干細胞

2、，命名為脫落乳牙干細胞SHEDs(stem cells from human exfoliated decidUOUS teeth，簡稱SHEDs)<'[2]>。 以往的研究表明，牙髓干細胞與骨髓間充質干細胞在體內具有不同的成骨功能<'[3，4]>。將DPSCs與HA/TCP共同植入裸鼠皮下，6周后在HA/TCP的表面，可形成牙本質一牙髓復合體類似結構，牙本質特異性蛋白DSPP及骨涎蛋白、骨鈣蛋白表達陽性。將SHEDs與HA/T

3、CP共同植入裸鼠皮下，則形成較多的骨組織及少量的牙本質結構<'[1，2]>。另有研究表明<'[5，6，7]>：體外誘導DPSCs可向骨組織分化，將DPSCs植入到免疫抑制大鼠皮下，可以形成具有血供的類似于人的骨組織結構。目前，SHEDs和DPSCs在體內成骨的功能尚不清楚。由于SHEDs和DPSCs在體外培養(yǎng)中具有較高的克隆形成能力及增殖速度，因此它們可能成為骨組織工程中的種子細胞。 本研究旨在利用與人體相近的大型動物小型豬研究

4、SHEDs和DPSCs在體內成骨功能及其條件。分為以下三個部分： 1．DPSCs和SHEDs生物學特性的研究取5～6月齡的小型豬下頜第一和第二乳切牙及12～13月齡小型豬下頜第一和第二恒切牙牙髓組織，用酶消化法和組織塊法體外培養(yǎng)SHEDs和DPSCs。DPSCs在體外可傳代至20代，連續(xù)培養(yǎng)時間180天，細胞狀態(tài)良好。SHEDs在第6代后增殖速度明顯下降，體外生長約至7～8代，連續(xù)培養(yǎng)時間80天。兩者有明顯區(qū)別。第三代SHEDs

5、和DPSCs細胞倍增時間分別為4.2天和4.8天，SHEDs生長速度略快。25 cm<'2>的細胞培養(yǎng)瓶中接種2000個細胞，SHEDs克隆集落形成率為13/2000個細胞，DPSCs克隆集落形成率為7/2000個細胞。免疫熒光染色檢測細胞生物學特性，SHEDs和DPSCs均表達間充質來源細胞的典型蛋白Vimentin，且1/5左右的細胞表達基質祖細胞較特異性的標志物Stro-1。與骨髓間充質干細胞不同的是SHEDs和DPSCs均表達神

6、經干細胞特異性標志nestin和神經元發(fā)育早期的標志β-tubulin Ⅲ。 2．SHEDs和DPSCs的體外誘導分化分別取第3代小型豬DPSCs和SHEDs，體外向骨組織、脂肪組織及神經組織誘導分化。DPSCs和SHEDs在含有15﹪胎牛血清、地塞米松、β甘油磷酸鈉和維生素C的培養(yǎng)液誘導3周，Yon-kossa染色呈現(xiàn)高密度黑色陽性反應區(qū)域，ALP表達明顯。經IBMX、胰島素、消炎痛和氫化可的松誘導3周后，DPSCs和SHED

7、s均可分化為脂肪細胞，經油紅染色可見橙紅色陽性顆粒。挑選單克隆Stro-1陽性的SHEDs和DPSCs擴增后向神經細胞誘導分化，誘導后免疫熒光鑒定β-tubulin Ⅲ表達陽性， Stro-1表達陰性。體外培養(yǎng)的DPSCs和SHEDs均具有多向分化潛能，誘導分化情況無明顯差別。 3．SHEDs和DPSCs與生物材料復合對小型豬下頜骨缺損修復的研究將標記有綠色熒光蛋白的SHEDs和DPSCs體外與磷酸三鈣復合，掃描電鏡觀察細胞生長

8、狀況，然后回植到小型豬下頜骨骨缺損模型(大缺損2.5×1.5×1.5cm<'3>和小缺損0.5×1.0×1.0cm<'3>)上，觀察其骨修復功能及其在體內轉歸。在16只小型豬下頜骨上制備左右對稱的16個小缺損和單側的8個大缺損，隨機分為4組手術回植：實驗組1：SHEDs+β-FCP組；實驗組2：DPSCs+β-TCP組；對照組：單純β-TCP組；空白對照組：骨缺損處無細胞，無材料。術后2周、4周、3個月、6個月，將小型豬分批按實驗計劃處

9、死，進行熒光檢查、影像學檢查、宏觀測量及組織學檢查。熒光顯微鏡示，大量的乳牙牙髓干細胞已分化為骨細胞，被包埋在骨基質中，具有骨小梁結構，部分乳牙牙髓干細胞長入材料間隙。術后6個月大體觀察及CT顯示，SHEDs+β-TCP組下頜骨明顯肥大，成骨功能最強。DPSCs+β-TCP組下頜骨也有較強的修復，組織學檢查未見牙髓一牙本質樣結構形成。單純β-FCP有部分纖維組織修復骨組織，在空白對照組，可見下頜骨仍留有較大缺損。 總之：體外培養(yǎng)