山羊乳牙牙髓細(xì)胞向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的體內(nèi)外研究.pdf

1、背景：
　　 骨量不足的問題一直是困擾口腔種植外科發(fā)展的一大難題，自體骨，異體骨和組織工程骨是目前骨組織缺損修復(fù)的三大來源。其中，自體骨由于來源受限及給患者帶來二次創(chuàng)傷，異體骨由于免疫排斥性等缺陷限制其各自在臨床上的應(yīng)用，相比較而言，組織工程骨由于具有自生性，無免疫排他性，安全性，已成為目前骨缺損修復(fù)的研究熱點(diǎn)。自從Gronthos 等[1]發(fā)現(xiàn)人恒牙牙髓來源的細(xì)胞中存在干細(xì)胞以來，有關(guān)運(yùn)用牙髓來源干細(xì)胞組織工程化成骨的研究不斷

2、深入，Mirus 等[2]證實(shí)相比較人恒牙牙髓干細(xì)胞（human Dental pulp stem cells , DPSCs）而言，人乳牙牙髓干細(xì)胞（Stem cells from human exfoliated deciduous teeth, SHED）具有更佳的成骨分化誘導(dǎo)能力，其更適合作為頜面骨缺損組織工程骨修復(fù)的種子細(xì)胞。
　　 目的：
　　 （1）分離培養(yǎng)山羊乳牙牙髓細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行相關(guān)干

3、細(xì)胞特性鑒定。
　　 （2）礦化誘導(dǎo)山羊乳牙牙髓細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)細(xì)胞，比較兩種細(xì)胞體外礦化成骨能力。
　　 （3）比較山羊乳牙牙髓細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)細(xì)胞復(fù)合多孔磷酸鈣骨水泥（pCPC）支架材料回植于裸鼠皮下成骨效果。
　　 方法：
　　 （1）全麻下拔除山羊第一、二乳前磨牙，采用改良酶解組織塊法培養(yǎng)山羊乳牙牙髓細(xì)胞；抽取山羊髂前上嵴區(qū)骨髓，采用全骨髓法培養(yǎng)山羊骨髓間充質(zhì)細(xì)胞。
　　 （2）體外培養(yǎng)擴(kuò)

4、增山羊乳牙牙髓細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長情況，采用免疫組織化學(xué)法檢測細(xì)胞來源，流式細(xì)胞儀檢測干細(xì)胞表面標(biāo)記物（STRO-1），MTT法檢測細(xì)胞增殖情況。
　　 （3）體外培養(yǎng)擴(kuò)增山羊乳牙牙髓細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)成骨誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基（含地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C）培養(yǎng)后觀察細(xì)胞生長情況，采用堿性磷酸酶（ALP）染色法、茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色法檢測細(xì)胞體外礦化能力；采用RT-PCR 和Real-time PCR 技術(shù)檢測

5、成骨基因ALP、COL-I、OPN、OCN 表達(dá)情況；采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測成骨標(biāo)記物OCN 在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況；通過掃描電鏡觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞在pCPC 支架材料上黏附、增殖情況。
　　 （ 4）將體外培養(yǎng)擴(kuò)增誘導(dǎo)7d 后的山羊乳牙牙髓細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)細(xì)胞按2×107cell/ml 密度接種于支架材料pCPC 支架材料上，異位回植于裸鼠皮下；8w 后，取出移植物，石蠟包埋切片后分別HE 染色、免疫組織化學(xué)染色觀察骨組織形成及

6、成骨蛋白（OCN）表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 （1）采用改良酶解組織塊法培養(yǎng)山羊乳牙牙髓細(xì)胞，一般3-4d 組織塊周圍有細(xì)胞“游離”，6-7d 游離出細(xì)胞的組織塊周圍可見細(xì)胞“生長暈”形成，14-18d 組織塊間細(xì)胞增殖相接，細(xì)胞間相互擠壓，可以進(jìn)行首次傳代；傳代后， 5d 細(xì)胞鋪滿皿底90％以上；采用全骨髓法培養(yǎng)山羊骨髓間充質(zhì)細(xì)胞， 5-7d 首次換液后，就可以看到細(xì)胞克隆形成，15-20d 后可以首次傳代；傳代后

7、， 7d 細(xì)胞鋪滿皿底90％以上。
　　 （2）倒置相差顯微鏡下觀察，山羊乳牙牙髓細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)均呈“成纖維細(xì)胞”樣，免疫組化來源檢測胞漿抗角蛋白陰性、抗波絲蛋白陽性，說明均來源于間充質(zhì)；流式細(xì)胞儀檢測：第一代乳牙牙髓細(xì)胞表面表達(dá)STRO-1 陽性率為11.6％，第一代骨髓間充質(zhì)細(xì)胞表面表達(dá)STRO-1 陽性率為15.33％。MTT 法檢測顯示山羊乳牙牙髓細(xì)胞倍增時(shí)間為4.38d，骨髓間充質(zhì)細(xì)胞倍增時(shí)間為5.69d，說

8、明山羊乳牙牙髓細(xì)胞增殖能力較骨髓間充質(zhì)細(xì)胞強(qiáng)。
　　 （3）礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)后，堿性磷酸酶（ALP）活性試驗(yàn)顯示山羊乳牙牙髓細(xì)胞誘導(dǎo)7d 后OD 值為1.33±0.009，ALP 活性顯著增加，14d 后OD 值為3.59±0.107,ALP 活性達(dá)最高；山羊骨髓間充質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)10d 后OD 值為2.03±0.027，ALP 活性顯著增加，14d 后OD 值為3.49±0.647，ALP 活性達(dá)最高；茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色法顯示誘導(dǎo)21d

9、 后山羊乳牙牙髓細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)細(xì)胞均能分泌胞外基質(zhì)，形成礦化結(jié)節(jié)；
　　 RT-PCR 及Real-time PCR 顯示山羊乳牙牙髓細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)細(xì)胞成骨誘導(dǎo)前后均表達(dá)成骨基因ALP、COL-I、OPN、OCN，但誘導(dǎo)后表達(dá)量增加，其中ALP、OCN相對(duì)表達(dá)量增加顯著；掃描電鏡試驗(yàn)顯示誘導(dǎo)7d 后山羊乳牙牙髓細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)細(xì)胞能夠很好的黏附于pCPC 支架材料上，并能夠在其上增殖、分泌胞外基質(zhì)。
　　 （4）裸鼠

10、皮下異位移植8w 后，標(biāo)本切片HE 染色顯示山羊乳牙牙髓細(xì)胞新生骨樣組織量顯著多于骨髓間充質(zhì)細(xì)胞，新生骨樣組織百分比分別為20.81±4.50％、13.18±1.05％（P<0.05）；單純材料組切片HE 染色顯示無骨樣組織形成，可見部分未被吸收的材料顆粒及形成的血管組織；免疫組織化學(xué)染色顯示圍繞骨樣組織周圍的成骨樣細(xì)胞胞漿抗OCN 染色陽性。
　　 結(jié)論：
　　 （1）改良酶解組織塊法可以較快地培養(yǎng)出山羊乳牙牙髓細(xì)胞；

11、干細(xì)胞表面標(biāo)記抗原（STRO-1）流式細(xì)胞儀檢測顯示培養(yǎng)的山羊乳牙牙髓細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)細(xì)胞中均存在干細(xì)胞；相比較山羊骨髓間充質(zhì)細(xì)胞，山羊乳牙牙髓細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力。
　　 （2）成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后山羊乳牙牙髓細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)細(xì)胞具有相似的體外成骨能力和成骨基因表達(dá)模式。
　　 （3）裸鼠皮下異位移植8w 后，山羊乳牙牙髓細(xì)胞或骨髓間充質(zhì)細(xì)胞復(fù)合pCPC 支架材料形成骨樣組織，且乳牙牙髓細(xì)胞異位成骨能力明顯強(qiáng)于骨髓間充質(zhì)細(xì)