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文檔簡介
1、背景:
骨量不足的問題一直是困擾口腔種植外科發(fā)展的一大難題,自體骨,異體骨和組織工程骨是目前骨組織缺損修復(fù)的三大來源。其中,自體骨由于來源受限及給患者帶來二次創(chuàng)傷,異體骨由于免疫排斥性等缺陷限制其各自在臨床上的應(yīng)用,相比較而言,組織工程骨由于具有自生性,無免疫排他性,安全性,已成為目前骨缺損修復(fù)的研究熱點。自從Gronthos 等[1]發(fā)現(xiàn)人恒牙牙髓來源的細胞中存在干細胞以來,有關(guān)運用牙髓來源干細胞組織工程化成骨的研究不斷
2、深入,Mirus 等[2]證實相比較人恒牙牙髓干細胞(human Dental pulp stem cells , DPSCs)而言,人乳牙牙髓干細胞(Stem cells from human exfoliated deciduous teeth, SHED)具有更佳的成骨分化誘導(dǎo)能力,其更適合作為頜面骨缺損組織工程骨修復(fù)的種子細胞。
目的:
(1)分離培養(yǎng)山羊乳牙牙髓細胞和骨髓間充質(zhì)細胞,并對其進行相關(guān)干
3、細胞特性鑒定。
(2)礦化誘導(dǎo)山羊乳牙牙髓細胞和骨髓間充質(zhì)細胞,比較兩種細胞體外礦化成骨能力。
(3)比較山羊乳牙牙髓細胞和骨髓間充質(zhì)細胞復(fù)合多孔磷酸鈣骨水泥(pCPC)支架材料回植于裸鼠皮下成骨效果。
方法:
(1)全麻下拔除山羊第一、二乳前磨牙,采用改良酶解組織塊法培養(yǎng)山羊乳牙牙髓細胞;抽取山羊髂前上嵴區(qū)骨髓,采用全骨髓法培養(yǎng)山羊骨髓間充質(zhì)細胞。
(2)體外培養(yǎng)擴
4、增山羊乳牙牙髓細胞、骨髓間充質(zhì)細胞,觀察細胞生長情況,采用免疫組織化學(xué)法檢測細胞來源,流式細胞儀檢測干細胞表面標(biāo)記物(STRO-1),MTT法檢測細胞增殖情況。
(3)體外培養(yǎng)擴增山羊乳牙牙髓細胞、骨髓間充質(zhì)細胞,經(jīng)成骨誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基(含地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C)培養(yǎng)后觀察細胞生長情況,采用堿性磷酸酶(ALP)染色法、茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色法檢測細胞體外礦化能力;采用RT-PCR 和Real-time PCR 技術(shù)檢測
5、成骨基因ALP、COL-I、OPN、OCN 表達情況;采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測成骨標(biāo)記物OCN 在細胞內(nèi)的表達情況;通過掃描電鏡觀察誘導(dǎo)后細胞在pCPC 支架材料上黏附、增殖情況。
( 4)將體外培養(yǎng)擴增誘導(dǎo)7d 后的山羊乳牙牙髓細胞、骨髓間充質(zhì)細胞按2×107cell/ml 密度接種于支架材料pCPC 支架材料上,異位回植于裸鼠皮下;8w 后,取出移植物,石蠟包埋切片后分別HE 染色、免疫組織化學(xué)染色觀察骨組織形成及
6、成骨蛋白(OCN)表達情況。
結(jié)果:
(1)采用改良酶解組織塊法培養(yǎng)山羊乳牙牙髓細胞,一般3-4d 組織塊周圍有細胞“游離”,6-7d 游離出細胞的組織塊周圍可見細胞“生長暈”形成,14-18d 組織塊間細胞增殖相接,細胞間相互擠壓,可以進行首次傳代;傳代后, 5d 細胞鋪滿皿底90%以上;采用全骨髓法培養(yǎng)山羊骨髓間充質(zhì)細胞, 5-7d 首次換液后,就可以看到細胞克隆形成,15-20d 后可以首次傳代;傳代后
7、, 7d 細胞鋪滿皿底90%以上。
(2)倒置相差顯微鏡下觀察,山羊乳牙牙髓細胞、骨髓間充質(zhì)細胞形態(tài)均呈“成纖維細胞”樣,免疫組化來源檢測胞漿抗角蛋白陰性、抗波絲蛋白陽性,說明均來源于間充質(zhì);流式細胞儀檢測:第一代乳牙牙髓細胞表面表達STRO-1 陽性率為11.6%,第一代骨髓間充質(zhì)細胞表面表達STRO-1 陽性率為15.33%。MTT 法檢測顯示山羊乳牙牙髓細胞倍增時間為4.38d,骨髓間充質(zhì)細胞倍增時間為5.69d,說
8、明山羊乳牙牙髓細胞增殖能力較骨髓間充質(zhì)細胞強。
(3)礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)后,堿性磷酸酶(ALP)活性試驗顯示山羊乳牙牙髓細胞誘導(dǎo)7d 后OD 值為1.33±0.009,ALP 活性顯著增加,14d 后OD 值為3.59±0.107,ALP 活性達最高;山羊骨髓間充質(zhì)細胞誘導(dǎo)10d 后OD 值為2.03±0.027,ALP 活性顯著增加,14d 后OD 值為3.49±0.647,ALP 活性達最高;茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色法顯示誘導(dǎo)21d
9、 后山羊乳牙牙髓細胞、骨髓間充質(zhì)細胞均能分泌胞外基質(zhì),形成礦化結(jié)節(jié);
RT-PCR 及Real-time PCR 顯示山羊乳牙牙髓細胞、骨髓間充質(zhì)細胞成骨誘導(dǎo)前后均表達成骨基因ALP、COL-I、OPN、OCN,但誘導(dǎo)后表達量增加,其中ALP、OCN相對表達量增加顯著;掃描電鏡試驗顯示誘導(dǎo)7d 后山羊乳牙牙髓細胞、骨髓間充質(zhì)細胞能夠很好的黏附于pCPC 支架材料上,并能夠在其上增殖、分泌胞外基質(zhì)。
(4)裸鼠
10、皮下異位移植8w 后,標(biāo)本切片HE 染色顯示山羊乳牙牙髓細胞新生骨樣組織量顯著多于骨髓間充質(zhì)細胞,新生骨樣組織百分比分別為20.81±4.50%、13.18±1.05%(P<0.05);單純材料組切片HE 染色顯示無骨樣組織形成,可見部分未被吸收的材料顆粒及形成的血管組織;免疫組織化學(xué)染色顯示圍繞骨樣組織周圍的成骨樣細胞胞漿抗OCN 染色陽性。
結(jié)論:
(1)改良酶解組織塊法可以較快地培養(yǎng)出山羊乳牙牙髓細胞;
11、干細胞表面標(biāo)記抗原(STRO-1)流式細胞儀檢測顯示培養(yǎng)的山羊乳牙牙髓細胞和骨髓間充質(zhì)細胞中均存在干細胞;相比較山羊骨髓間充質(zhì)細胞,山羊乳牙牙髓細胞具有更強的增殖能力。
(2)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后山羊乳牙牙髓細胞、骨髓間充質(zhì)細胞具有相似的體外成骨能力和成骨基因表達模式。
(3)裸鼠皮下異位移植8w 后,山羊乳牙牙髓細胞或骨髓間充質(zhì)細胞復(fù)合pCPC 支架材料形成骨樣組織,且乳牙牙髓細胞異位成骨能力明顯強于骨髓間充質(zhì)細
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