穿山龍總皂苷體內體外對NF-κB p65、STAT3及AP-1表達的影響.pdf

1、類風濕性關節(jié)炎(rheumatoidarthritis,RA)是一種以多對稱性關節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的慢性自身免疫功能障礙性疾病。關節(jié)滑膜炎癥細胞浸潤、血管新生增多、滑膜血管翳形成、軟骨及骨組織侵蝕是RA的主要病理學特征。血管新生是產生和維持RA血管翳的必需條件,因此,抑制血管新生可能是治療RA的一個新的靶點。本課題組前期體內實驗研究發(fā)現(xiàn)穿山龍總皂苷可以減少膠原誘導性關節(jié)炎(collagen-inducedarthritis,CIA)大鼠

2、關節(jié)滑膜組織的新生血管數(shù)量,顯著性下調血管內皮細胞生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)及其受體的表達,進一步證明了抑制血管新生可以作為治療RA的靶點,抑制血管新生是穿山龍總皂苷治療RA的機制之一;在體外,IL-17聯(lián)合TNF-α能夠刺激大鼠滑膜細胞株RSC-364細胞分泌大量VEGF,此作用可以被核轉錄因子-κB(nucleartranscriptionfactors-κB,NF-κB)特

3、異性阻斷劑PDTC部分阻斷,說明NF-κB途徑不是調控VEGF產生的唯一途徑;并且在實驗中證實穿山龍總皂苷能夠抑制炎性因子誘導的RSC-364細胞VEGF的分泌。
　　本研究在前期對穿山龍總皂苷抑制血管新生作用的研究基礎上,以膠原誘導性關節(jié)炎大鼠(CIA)和大鼠滑膜細胞株RSC-364細胞模型為研究對象,通過體內、體外實驗觀察穿山龍總皂苷對NF-κBp65、信號轉導子和轉錄激活因子3(signaltransducerandacti

4、vatoroftranscription3,STAT3)及激活蛋白-1(activatorprotein-1,AP-1)表達的影響,進一步闡明穿山龍總皂苷通過抑制血管新生治療RA的調控機制。
　　第一部分:穿山龍總皂苷對CIA大鼠關節(jié)滑膜組織NF-κBp65、STAT3及AP-1表達的影響
　　目的:
　　通過觀察穿山龍總皂苷對膠原誘導性關節(jié)炎(CIA)大鼠滑膜組織NF-κBp65、STAT3及AP-1表達的影響,深入

5、探討穿山龍總皂苷抑制類風濕性關節(jié)炎血管新生可能的信號轉導通路作用機制。
　　方法:
　　健康清潔級Wistar大鼠100只,隨機取24只做正常對照組,其余76只大鼠均建立CIA模型。將造模成功的72只CIA大鼠隨機分為3組:CIA模型組、雷公藤組(陽性對照組)、穿山龍總皂苷組,每組24只。在初次免疫后第16d起,雷公藤組大鼠給予雷公藤多甙片(12mg·kg﹣1·d﹣1)灌胃,穿山龍總皂苷組大鼠給予穿山龍總皂苷(25mg·kg

6、﹣1·d﹣1)灌胃,正常組和CIA模型組大鼠分別給予等體積溶媒(0.5％CMC)灌胃,各組連續(xù)用藥時間均為35d。
　　分別于16d,23d,30d,37d,44d,50d觀察各組大鼠關節(jié)炎指數(shù)(arthritisindex,AI)評分的變化情況;應用TransAMTMNF-κBp65活性檢測試劑盒檢測滑膜組織中NF-κBp65的DNA結合活性;免疫組織化學染色方法觀察滑膜組織中STAT3蛋白的表達;原位雜交方法檢測滑膜組織AP-

7、1的兩個亞單位c-fos和c-jun的mRNA表達水平;凝膠電泳遷移率實驗(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)檢測滑膜組織核蛋白提取物AP-1的DNA結合活性。
　　結果:
　　1.大鼠治療前后不同時間點關節(jié)炎指數(shù)(AI)評分
　　大鼠初次免疫后14d逐漸出現(xiàn)足趾部及踝關節(jié)皮膚發(fā)紅,輕度腫脹等關節(jié)炎癥狀。造模成功分組以后分別于16d,23d,30d,37d,44d,50d檢測

8、各組大鼠AI評分,CIA模型組大鼠AI值在不同時間點與正常對照組相比均有顯著性差異(P<0.01);雷公藤組、穿山龍總皂苷組均可明顯抑制CIA大鼠AI值(P<0.01);兩治療組之間比較無顯著性差異(P>0.05)。
　　2.各組大鼠滑膜組織核蛋白提取物NF-κBp65的DNA結合活性
　　CIA模型組與正常對照組比較,大鼠滑膜組織核蛋白提取物中NF-κBp65的DNA結合活性顯著增高(P<0.01);與CIA模型組相比,雷

9、公藤組、穿山龍總皂苷組的NF-κBp65DNA結合活性均顯著降低(P<0.01);兩治療組之間比較無顯著性差異(P>0.05)。
　　3.各組大鼠關節(jié)滑膜組織STAT3蛋白的表達
　　STAT3免疫組化陽性產物黃色或棕黃色顆粒主要分布于細胞漿,少量在細胞核中。STAT3蛋白在CIA模型組大鼠關節(jié)滑膜中的表達與正常對照組相比顯著增多(P<0.01);與CIA模型組相比,雷公藤組、穿山龍總皂苷組STAT3蛋白的表達均顯著減少(P

10、<0.01);兩治療組之間兩兩比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　4.各組大鼠關節(jié)滑膜組織中c-fosmRNA的表達
　　c-fosmRNA陽性信號主要分布于細胞漿,細胞漿顯黃色或棕黃色顆粒為陽性反應。與正常對照組相比,CIA模型組大鼠關節(jié)滑膜組織可見到大量細胞漿染成棕黃色至棕褐色,c-fosmRNA的表達水平顯著增多(P<0.01);與CIA模型組相比,雷公藤組、穿山龍總皂苷組c-fosmRNA的表達水平均顯著減少(P

11、<0.01);兩治療組之間無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　5.各組大鼠關節(jié)滑膜組織中c-junmRNA的表達
　　c-junmRNA陽性反應主要分布于細胞漿,細胞漿顯黃色或棕黃色顆粒。與正常對照組相比,CIA模型組大鼠關節(jié)滑膜組織可見到大量細胞漿染成棕黃色至棕褐色,c-junmRNA的表達水平顯著增多(P<0.01);與CIA模型組相比,雷公藤組、穿山龍總皂苷組c-junmRNA的表達水平均顯著減少(P<0.01);兩治

12、療組之間比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　6.各組大鼠滑膜組織核蛋白提取物AP-1的DNA結合活性
　　與正常對照組比較,CIA模型組滑膜組織核蛋白提取物AP-1的結合活性顯著增高(P<0.01);與CIA模型組相比,雷公藤組、穿山龍總皂苷組的AP-1DNA結合活性均顯著降低(P<0.01)。
　　結論:
　　1.CIA模型大鼠關節(jié)炎指數(shù)(AI)在16d、23d、30d、37d、44d、50d各時間點均高于

13、正常對照組,穿山龍總皂苷治療后可以降低CIA大鼠的AI值。
　　2.本研究首次證明穿山龍總皂苷灌胃給藥治療可以使CIA大鼠關節(jié)滑膜組織NF-κBp65、AP-1的DNA結合活性及STAT3蛋白的表達顯著降低;c-fos和c-junmRNA的表達顯著減少,提示穿山龍總皂苷可以在體內通過上述信號轉導途徑影響血管新生關鍵因子VEGF的產生,從而起到抑制類風濕性關節(jié)炎血管新生的作用。
　　第二部分:穿山龍總皂苷含藥血清對IL-17和

14、TNF-α誘導的大鼠滑膜細胞株RSC-364NF-κBp65、STAT3及AP-1表達的影響
　　目的:
　　通過體外實驗觀察穿山龍總皂苷含藥血清對IL-17和TNF-α聯(lián)合誘導的大鼠滑膜細胞株RSC-364NF-κBp65、STAT3及AP-1表達的影響,探討穿山龍總皂苷抑制類風濕性關節(jié)炎血管新生可能的信號轉導通路作用機制。
　　方法:
　　制備穿山龍總皂苷和雷公藤(陽性對照)含藥血清;取大鼠滑膜細胞株RSC-

15、364經IL-17(10μg/L)和TNF-α(10μg/L)、穿山龍總皂苷含藥血清、雷公藤多甙片含藥血清單獨或聯(lián)合應用孵育,孵育24h,提取各組細胞核蛋白用于TransAMTMNF-κBp65活性檢測試劑盒檢測NF-κBp65的DNA結合活性及EMSA方法檢測AP-1的DNA結合活性;提取各組細胞總蛋白后應用Westernblot方法觀察STAT3蛋白的表達。
　　結果:
　　1.各組滑膜細胞核蛋白提取物NF-κBp65的

16、DNA結合活性
　　與空白對照組比較,IL-17+TNF-α誘導的細胞模型組細胞核蛋白提取物中NF-κBp65的DNA結合活性顯著增高(P<0.01);與細胞模型組相比,雷公藤含藥血清組、穿山龍總皂苷含藥血清組的NF-κBp65DNA結合活性均顯著降低(P<0.01),且兩組之間比較無顯著性差異(P>0.05)。
　　2.各組滑膜細胞STAT3蛋白的表達
　　STAT3蛋白在細胞模型組的表達與空白對照組相比顯著增多(P

17、<0.01);與細胞模型組相比,雷公藤含藥血清組、穿山龍總皂苷含藥血清組STAT3蛋白的表達顯著減少(P<0.01),且兩組之間比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　3.各組滑膜細胞核蛋白提取物AP-1的DNA結合活性
　　與空白對照組比較,細胞模型組滑膜細胞核蛋白提取物AP-1的DNA結合活性顯著增高(P<0.01);與細胞模型組相比,雷公藤含藥血清組、穿山龍總皂苷含藥血清組AP-1的DNA結合活性降低(P<0.05),