白藜蘆醇對膿毒癥大鼠急性腎損傷的保護(hù)作用及其對NF-κB p65表達(dá)的影響.pdf

1、膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程中，隨著難以控制的炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致機(jī)體多個器官出現(xiàn)急性功能損傷，進(jìn)而發(fā)展為嚴(yán)重膿毒癥、膿毒性休克和多器官功能衰竭(Multiple Organ Dysfunction Syndrome，MODS)。而腎臟是瀑布式炎癥反應(yīng)的最常攻擊器官之一。急性腎損傷(AcuteKidney Injury，AKI)是膿毒癥最常見的并發(fā)癥之一。腎臟損傷后將導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)環(huán)境紊亂，繼而誘發(fā)或加重機(jī)體其他器官的損傷，導(dǎo)致MODS。盡管AKI在膿毒癥

2、患者中有很高的發(fā)病率及病死率，然而對膿毒癥所致AKI的研究相對較少。研究顯示，膿毒癥患者如果出現(xiàn)了腎功能輕度受損就可導(dǎo)致其病死率增加;如果在腎小球?yàn)V過率(GlomerularFiltration Rate，GFR)仍處于正?；騽偝霈F(xiàn)輕度下降時的AKI階段就及時進(jìn)行干預(yù)治療，能夠明顯降低膿毒癥患者的病死率。因此，研究膿毒癥患者腎臟早期損傷的病理生理學(xué)改變的機(jī)制、尋找新的有效治療膿毒癥AKI的方法，是我們目前迫切需要研究的難題。
　　

3、NF-κB是1986年研究者在鼠成熟B細(xì)胞和粒細(xì)胞瘤中被發(fā)現(xiàn)的，并命名為細(xì)胞核KapPa輕鏈基因表達(dá)的調(diào)節(jié)子，后來研究發(fā)現(xiàn)其幾乎存在于所有的細(xì)胞中。目前所知NF-κB/Rel家族成員包括RelA(P65)、RelB、c-Rel、v-Rel、p50、p52等。NF-κB活化后能增強(qiáng)TNFα、IL-1、IL-2基因的轉(zhuǎn)錄，使TNF-α、IL-1β和IL2的產(chǎn)生和釋放增加，然后再激活NF-κB。它也可以使IL-6、IL-8這些炎性細(xì)胞因子的水

4、平釋放增加，進(jìn)一步放大導(dǎo)致初始炎癥的信號，加重機(jī)體微循環(huán)的損傷，直到DIC或死亡。這種情況在膿毒綜合征(Sepsis Syndrome)、急性呼吸窘迫綜合征（Acute Respiratory Distress Syndrome，ARDS）更為常見。但這種情況不會無限制地發(fā)生在疾病的過程中，因?yàn)镹F-κB具有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。
　　白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種非黃酮類的酚類物質(zhì)。天然的白藜蘆醇在很多植物中存在，是

5、植物為了抵御病菌入侵而產(chǎn)生的一種抗毒型物質(zhì)。白藜蘆醇有著強(qiáng)抗氧化能力是一種非合成的植物抗氧化劑，研究顯示它能夠抑制血小板的聚集、舒張血管、降低血液的粘稠度，對腫瘤的發(fā)生也有一定的抑制作用，可以用來治療冠心病、高脂血癥及缺血性心臟疾病。研究還發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇有類似于雌激素的作用，因此也被嘗試用于乳腺癌方面的治療。上世紀(jì)90年代，我國也開始了對白藜蘆醇的研究，發(fā)現(xiàn)其除了對心臟及腫瘤有一定的治療作用外，還能夠起到控制體重，改善微循環(huán)等作用。

6、>　　NF-κB在腎損傷相關(guān)疾病中被廣泛關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)腎損傷時NF-κB的表達(dá)會上升，進(jìn)而進(jìn)展為一系列炎癥反應(yīng)。白藜蘆醇因具有抗炎、抗氧化、改善微循環(huán)等功效而被廣泛關(guān)注，近幾年被很多學(xué)者用于膿毒癥治療方面的動物實(shí)驗(yàn)研究，均得出較為肯定的結(jié)果，即白藜蘆醇可有效改善膿毒癥引起的損傷，包括肺損傷、腦損傷等。研究還發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可改善很多類型的腎損傷，包括糖尿病腎損傷、缺血再灌注損傷、藥物相關(guān)性損傷等。我們假想膿毒癥急性腎損傷時，NF-κB會發(fā)生

7、一些變化，但具體怎樣變化，受什么因子的調(diào)控，白藜蘆醇對其干預(yù)后會發(fā)生什么變化，是我們此次研究主要的目的和方向。
　　目的：
　　本研究擬通過盲腸結(jié)扎與穿孔術(shù)(Cecal Ligation and Puncture，CLP)制備大鼠膿毒癥誘發(fā)AKI模型，是模仿腹腔膿毒癥感染的臨床過程，引起多菌群感染，最終導(dǎo)致膿毒癥。初步探討白藜蘆醇對膿毒癥大鼠AKI的保護(hù)作用及可能的作用機(jī)制，為白藜蘆醇應(yīng)用于膿毒癥的臨床治療提供更多的理論基礎(chǔ)

8、和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1、飼養(yǎng)20只SD雄性大鼠，隨機(jī)分為Sham組、CLP組兩組，采用CLP術(shù)建立大鼠膿毒癥大鼠模型，分別于CLP術(shù)后0h、6h、12h、24h采血，ELISA方法檢測比較兩組大鼠在不同時間點(diǎn)炎癥因子及腎功變化，做病理切片觀察大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)變化，以明確12h為膿毒癥腎損傷造模成功的時間點(diǎn)。
　　2、飼養(yǎng)50只SD雄性大鼠，體重約為170-220g，隨機(jī)分為Sham組、Sham+RES(3mg

9、/kg)組、CLP組、CLP+RES(3mg/kg)組與CLP+RES(10mg/kg)組5組，每組10只，做病理切片觀察腎臟組織結(jié)構(gòu)變化，采用ELISA方法測小鼠血清腎功能、腎損傷指標(biāo)，炎癥因子變化，計(jì)算大鼠生存率，用Western blot法檢測NF-κB P65及SIRT1蛋白表達(dá)情況，以證實(shí)白藜蘆醇對腎組織的保護(hù)作用。
　　3、使用腎小球系膜細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，造腎小球系膜細(xì)胞LPS模型，再通過白藜蘆醇對腎小球系膜細(xì)胞進(jìn)行干

10、預(yù)，以及用SIRT1RNAi干擾SIRT1后，用Western blot法分別檢測NF-κB P65及SIRT1蛋白表達(dá)情況，從而探討白藜蘆醇調(diào)控NF-κB P65可能的機(jī)制。
　　4、應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。本研究所得到的所有計(jì)量資料，都用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(X)±S）表示，兩組以上比較采用方差分析，首先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差不齊時采用Welch檢驗(yàn)結(jié)果。多組均數(shù)間兩兩比較:方差齊者用最小顯著差值法（Least-

11、significant Difference，LSD），方差不齊者用Dunnett'T3法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。膿毒癥合并AKI的生存曲線之間的關(guān)系采用Kaplan-Meier進(jìn)行檢驗(yàn)。
　　結(jié)果:
　　1.Sham組術(shù)后各時間點(diǎn)亞組間血清Scr、BUN、ScysC、NGAL、KIM-1、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);而在CLP組中，術(shù)后各時間點(diǎn)亞組間血清Scr與

12、BUN、ScysC、NGAL、KIM-1、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10隨時間延長而升高，與0h比較，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　2.Sham組與Sham+RES組術(shù)后組間血清Scr、BUN、、ScysC、NGAL、KIM-1、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、腎損傷指數(shù)、腎動脈血量、GFR濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);而CLP+RES不同濃度組中則可以清楚看出白藜蘆醇干預(yù)后的血清N

13、GAL、KIM-1濃度與CLP組比較有明顯的下降，并且隨RES濃度增加，效果更明顯，RES干預(yù)組與CLP組比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，而在血清Scr與BUN、Scys C、TNF-α、IL-1β、IL-6、腎損傷指數(shù)的檢測中，情況也與上述情況類似，在CLP+RES組不同濃度組中則可以清楚看出白藜蘆醇干預(yù)后的腎血流量與GFR、IL-10與CLP組比較有明顯的改善，并且隨RES濃度增加，它們的值明顯升高，RES干預(yù)組與CLP組比

14、較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　3.腎組織病理切片表現(xiàn)為CLP+RES的組別中，腎小球、腎間質(zhì)及腎小管炎癥病變明顯減輕，腎組織炎性細(xì)胞浸潤較相應(yīng)時間點(diǎn)CLP組減輕，并且生存時間與生存率遠(yuǎn)高于CLP組，證明白藜蘆醇對AKI的控制與逆轉(zhuǎn)有顯著的療效。
　　4.CLP組與Sham組術(shù)后組間NF-κ BP65蛋白表達(dá)水平比較有顯著的上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而CLP+RES組中則可以清楚看出白藜蘆醇干預(yù)后的

15、NF-κ BP65蛋白表達(dá)水平與CLP組比較有明顯的下降，RES干預(yù)組與CLP組比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。而SIRT1則相反。
　　5.LPS組較Control組SIRT1蛋白表達(dá)水平有顯著的下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而在LPS+RES組中則可以清楚看出白藜蘆醇干預(yù)后的SIRT1蛋白表達(dá)水平與LPS組比較有明顯的升高，RES干預(yù)組與LPS組比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);而對細(xì)胞轉(zhuǎn)染SIRT1

16、RNAi對SIRT1進(jìn)行阻斷后，可以看到SIRT1蛋白表達(dá)水平顯著下降。
　　6.在NF-κBP65蛋白去乙酰化檢測中可以發(fā)現(xiàn)，LPS組較Control組NF-κBP65去乙?；鞍妆磉_(dá)水平有顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而在LPS+RES組中則可以清楚看出白藜蘆醇干預(yù)后的NF-κ BP65去乙?；鞍妆磉_(dá)水平與LPS組比較有明顯的下降，RES干預(yù)組與LPS組比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);而對細(xì)胞轉(zhuǎn)染SIR