Kif2a基因沉默對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及機制研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腫瘤之一，在成人和兒童50-60％的顱內(nèi)腫瘤都是腦膠質(zhì)瘤，腦膠質(zhì)瘤發(fā)生率大概6.42例/100000。腦膠質(zhì)瘤患者5年存活率不到30％。
　　本研究首次探討了Kif2a基因在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況;并通過體外實驗研究了Kif2a基因在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移，侵襲，增殖和凋亡中的作用及分子機制;最后初步探討了Kif2a基因和在腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移過程中起到非常重要作用的HIF1α基因的關(guān)系。
　　第一部分

2、 Kif2a在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義
　　目的：
　　研究Kif2a在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及臨床意義。
　　方法：
　　標(biāo)本收集:
　　收集遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院2008～2013年間原發(fā)性腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本35例，另收集2014年山東大學(xué)齊魯醫(yī)院神經(jīng)外科住院患者手術(shù)切除的新鮮腦膠質(zhì)瘤組織35例，作為實驗組。且所有患者術(shù)前均未進行放療、化療等其他治療，并與患者或監(jiān)護人簽署實驗知情同意書后進入實驗進行研究。同時

3、取20例正常尸檢的腦組織標(biāo)本做為對照組。所有入組組織標(biāo)本按照WHO(2000)標(biāo)準(zhǔn)進行分級，Ⅰ-Ⅱ級15例，Ⅲ-Ⅳ級20例;男23例，女12例;平均年齡（4-70歲）。
　　1.應(yīng)用免疫組化法檢測高級別的腦膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織，不同級別的腦膠質(zhì)瘤組織Kif2a蛋白的表達(dá)情況。探討在高級別腦膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織及不同級別的腦膠質(zhì)瘤組織中Kif2a蛋白的表達(dá)情況及相互關(guān)系。
　　2.應(yīng)用Real-time PCR法檢測新鮮腦

4、膠質(zhì)瘤組織中Kif2a的mRNA表達(dá)情況與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。探討在不同級別腦膠質(zhì)瘤組織中Kif2a的mRNA表達(dá)情況及相互關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　免疫組化結(jié)果顯示35例高級別腦膠質(zhì)瘤組織和20例正常腦組織中都有Kif2a的陽性表達(dá)，與正常腦組織比較，高級別腦膠質(zhì)瘤組織表達(dá)率高于正常腦組織，且有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.001)。免疫組化檢測35例不同級別的腦膠質(zhì)瘤組織，高級別腦膠質(zhì)瘤組織表達(dá)率高于低級別腦膠質(zhì)瘤(P=0.044)

5、。Kif2a蛋白主要表達(dá)在胞質(zhì)及胞核，呈棕黃色顆粒，在高級別腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞胞漿中染色較強，在低級別腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常腦組織細(xì)胞中染色較淺。Real-time PCR法檢測新鮮膠質(zhì)瘤組織中Kif2a的mRNA表達(dá)。Kif2a表達(dá)隨著腦膠質(zhì)瘤級別增高而增強(P=0.033)。
　　結(jié)論：
　　Kif2a在高級別腦膠質(zhì)瘤中強表達(dá)，在低級別腦膠質(zhì)瘤和正常腦組織弱表達(dá)。Kif2a的表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤的病理分級，臨床分期相關(guān)。
　　

6、第二部分 Kif2a基因沉默對腦膠質(zhì)瘤A172增殖、凋亡、侵襲/遷移的影響
　　目的：
　　探討siRNA介導(dǎo)的Kif2a基因沉默對腦膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞系細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲遷移能力的影響;探討Kif2a基因沉默后抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長、侵襲及轉(zhuǎn)移的分子機制。
　　方法：
　　1.人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株篩選:腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系A(chǔ)172和U251細(xì)胞常規(guī)進行復(fù)蘇，傳代，獲取細(xì)胞，37℃，5％C02飽和濕度條件下，在含10％胎牛

7、血清和DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，提取A172和U251細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行PCR擴增，確定人腦膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞作為研究對象。
　　2.質(zhì)粒干擾率的測定:將細(xì)胞分Kif2a siRNA組和scrambled siRNA對照組，將對數(shù)生長期的A172細(xì)胞以2×105數(shù)目接種于6孔培養(yǎng)板中。用脂質(zhì)體liPofectamine2000分別轉(zhuǎn)染Kif2a siRNA和scrambled siRNA。轉(zhuǎn)染后48h，收集細(xì)胞，提

8、取細(xì)胞總RNA和總蛋白，應(yīng)用RT-PCR方法檢測不同實驗組中Kif2a的基因表達(dá)。應(yīng)用Western-blot方法檢測不同實驗組中Kif2a的蛋白表達(dá)。分析不同實驗組中A172細(xì)胞Kif2a的基因、蛋白表達(dá)情況。評價Kif2a siRNA組干擾效率。
　　3.利用CCK8檢測Kif2a基因沉默對腦人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系A(chǔ)172細(xì)胞增殖能力的影響:分別將指數(shù)生長期A172-Kif2a siRNA組和對照組細(xì)胞消化計數(shù)后按1×104個/孔接種

9、于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)3天，于第0、24、48和72h，采用CCK8方法檢測各組細(xì)胞增殖情況。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)檢測Kif2a基因沉默對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系A(chǔ)172細(xì)胞的凋亡率變化:取各組細(xì)胞消化計數(shù)后按2×105/孔接種于12孔板中，待細(xì)胞融合至約80％，收集細(xì)胞，AnnexinⅤ和PI染色后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率變化。
　　5.Transwell小室細(xì)胞侵襲實驗檢測Kif2a基因沉默對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系A(chǔ)172細(xì)胞侵襲

10、遷移能力的影響。取各組無血清A172細(xì)胞懸液100μl加入小室的上室，下室加入600μl含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)16h。光鏡下計數(shù)侵襲到濾膜背面的穿膜細(xì)胞數(shù)，評價細(xì)胞的侵襲遷移能力。
　　6.明膠酶譜法檢測Kif2a基因沉默對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞A172細(xì)胞MMP2、MMP9的表達(dá)的影響。
　　7.Western blot檢測Kif2a基因沉默對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系A(chǔ)172細(xì)胞PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路的

11、影響。
　　8.Western blot檢測Kif2a基因沉默對人腦膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞MMP2、MMP9蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1.Kif2a siRNA能夠有效下調(diào)Kif2a的表達(dá)。qRT-PCR檢測Kif2a siRNA敲除24h，48h時A172細(xì)胞中Kif2a的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)48h的敲除效率高(P=0.003)。Western blot進一步驗證A172細(xì)胞中Kif2a siRNA較對照組敲除48h時的效

12、率高。
　　2.CCK8法檢測Kif2a敲除對A172細(xì)胞增殖的影響。發(fā)現(xiàn)隨著時間延長，A172細(xì)胞Kif2a siRNA敲除組增殖率顯著低于對照組。
　　3.AnnexinⅤ/PI法檢測Kif2a siRNA及scrambled siRNA兩組敲除48h時A172細(xì)胞凋亡率。發(fā)現(xiàn)Kif2a敲除組較對照組相比，Kif2a敲除組顯著上調(diào)A172的凋亡率(P＜0.0001)。
　　4.Tanswell小室細(xì)胞侵襲實驗結(jié)果顯

13、示Kif2a siRNA敲除組A172細(xì)胞侵襲/遷移顯著低于對照組。
　　5.明膠酶譜檢測發(fā)現(xiàn)Kif2a siRNA敲除組上清中MMP2、MMP9的活性顯著低于scrambled siRNA組。
　　6.Westernblot分析發(fā)現(xiàn)Kif2a siRNA敲除組中，與膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲、遷移相關(guān)的AKT磷酸化水平下調(diào);MMP2蛋白表達(dá)水平下調(diào)。與膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖相關(guān)的p38MAPK磷酸化水平下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1.

14、Kif2a siRNA能夠有效的抑制A172細(xì)胞中Kif2a的表達(dá)，Kif2a基因沉默后A172細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力明顯降低，凋亡水平升高。
　　2.Kif2a通過PI3K/AKT和MAPK/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為中起著重要的作用。
　　3.Kif2a通過MMP調(diào)控人腦膠質(zhì)瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　第三部分 HIF1α在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)和意義及和Kif2a的關(guān)系
　　目的：
　　

15、研究HIF1α在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及臨床意義，并分析其與Kif2a之間的關(guān)系。
　　方法：
　　收集山東大學(xué)齊魯醫(yī)院神經(jīng)外科2013-2014年住院患者手術(shù)切除的新鮮腦膠質(zhì)瘤組織35例，所有標(biāo)本病理證實是人腦膠質(zhì)瘤組織并制備成石蠟切片，所有患者均為原發(fā)性，術(shù)前未行放療、化療和其他治療，所有患者及監(jiān)護人被告知進行實驗。所有患者組織標(biāo)本診斷按照WHO(2000)標(biāo)準(zhǔn)進行分級，Ⅰ-Ⅱ級15例，Ⅲ-Ⅳ級20例;男23例，女12例;

16、平均年齡（4-70歲）。
　　應(yīng)用免疫組化法檢測不同級別的腦膠質(zhì)瘤組織HIF1α蛋白的表達(dá)情況。檢測在不同級別的腦膠質(zhì)瘤組織中HIF1α蛋白的表達(dá)情況，并探討Kif2a與HIF1α在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1.HIF1α蛋白表達(dá)與臨床資料之間的關(guān)系。
　　免疫組化結(jié)果顯示HIF1α蛋白主要在細(xì)胞核和細(xì)胞漿中染色。35例腦膠質(zhì)瘤組織中HIF1α蛋白的陽性表達(dá)率是68.6％，20例Ⅲ-Ⅳ腦膠質(zhì)瘤切

17、片中，17(85.3％)例表達(dá)陽性，3(14.7％)例陰性表達(dá)。15例Ⅰ-Ⅱ腦膠質(zhì)瘤切片中，7(46.7％)例表達(dá)陽性，8(53.3％)例陰性表達(dá)。HIF1α蛋白在-Ⅱ低級別和Ⅲ-Ⅳ高級別腦膠質(zhì)瘤表達(dá)有差異性(P=0.027)。HIF1α在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)隨著腫瘤級別增高而成上升趨勢(P＜0.05)，HIF1α在腦膠質(zhì)瘤表達(dá)與患者年齡，性別、腫瘤大小及發(fā)生部位無關(guān)。
　　2.Kif2a和HIF1α蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)相關(guān)性。<