蒿甲醚聯(lián)合RNA干擾沉默VCAM1對膠質(zhì)瘤U87細胞生物學行為的影響.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腫瘤,可發(fā)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的任何部位,是臨床上療效較差的腫瘤之一。腦膠質(zhì)瘤因其粘附性強、遷移、侵襲快速的惡性生長方式,嚴重影響了預后。
　　 青蒿素是我國藥學工作者1971年從菊科植物黃花葉中提取分離到的一種具有過氧基因的倍半萜內(nèi)酯化合物,具有很強的抗瘧活性。近年來研究發(fā)現(xiàn)青篙素及其衍生物具有明顯的抗腫瘤作用和逆轉(zhuǎn)腫瘤的多重耐藥作用,蒿甲醚(Artemether)是青蒿素的重要衍生物之一,作為抗瘧藥物廣

2、泛應用于臨床,同時具有抗腫瘤作用。Artemether可透過血腦屏障進入腦組織,在體內(nèi)腦組織分布最高,為青蒿素的六倍。大量研究認為其抗腫瘤作用可能為抑制增殖,誘導凋亡,抑制血管生成。
　　 血管生成對實體瘤的生長和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要,腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移前血管生成明顯增強,腫瘤血管生成的速度和密集度與腫瘤的遷移、侵襲能力呈正相關(guān)。而血管內(nèi)皮細胞粘附分子1(VCAM1)等粘附分子在腫瘤的血管生成過程中起著很重要的作用。研究證明在膠質(zhì)瘤中VCAM

3、1高表達,同時,應用抗VCAM1的抗體作用C6膠質(zhì)瘤移植Vista大鼠,明顯抑制了腫瘤生長,延長了生存時間。通過阻止腫瘤新生血管形成,達到抑制腫瘤生長與惡化的目的已成為人們臨床抗腫瘤藥物的靶點之一。
　　 從原位的增殖性腫瘤到侵襲轉(zhuǎn)移癌的演進過程中,腫瘤細胞必須具備降解細胞外基質(zhì)的能力。細胞外基質(zhì)的降解主要依靠蛋白水解酶?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMP)是四類蛋白水解酶:絲氨酸蛋白酶、半胱

4、氨酸蛋白酶、天門冬氨酸蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶中較為重要的一類,目前已發(fā)現(xiàn)了14種,它們幾乎能降解細胞外基質(zhì)的所有成分,因而成為近年來腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移研究的熱點。研究證明基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的MMP2和MMP9在膠質(zhì)瘤細胞中均高表達,并在腫瘤的遷移和侵襲過程中起到重要作用,因此作為抑制膠質(zhì)瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的靶點得到廣泛關(guān)注。PI3K/Akt信號通路在腫瘤的增殖、凋亡、血管發(fā)生以及細胞運動中發(fā)揮著重要作用,研究證明PI3K/Akt信號通路與調(diào)節(jié)M

5、MP蛋白的表達。Artemether是否通過PI3K/Akt信號通路抑制MMP2和MMP9達到抑制膠質(zhì)瘤的效果,目前尚未見報道。
　　 本論文首先研究Artemether對人腦膠質(zhì)瘤U87細胞的作用效果與機制,在此基礎上,應用RNA干擾技術(shù)沉默VCAM1的表達,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染U87細胞,研究Artemether聯(lián)合RNA干擾沉默VCAM1對U87細胞遷移、侵襲、凋亡的作用效果和相關(guān)機制,旨在為人腦膠質(zhì)瘤的治療提供新的實驗依據(jù)。

6、　　 實驗材料和方法：
　　 一、實驗材料
　　 (一)實驗細胞株
　　 人膠質(zhì)瘤U87細胞株購自于南京凱基生物科技有限公司。
　　 (二)主要試劑
　　 蒿甲醚(云南昆明制藥廠),MTT,DMSO(美國Sigma公司),DMEM/F-12培養(yǎng)基(美國HyClone公司),胎牛血清(天津灝洋生物科技有限公司),AnnexinV/PI細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技有限公司),羊抗Akt1/2

7、多克隆抗體,兔抗P-Akt1/2/3(Ser473)多克隆抗體,兔抗MMP2多克隆抗體,羊抗MMP9多克隆抗體,兔抗VCAM1多克隆抗體,小鼠抗β-actin單克隆抗體,增強化學發(fā)光法試劑盒(美國SantaCruz公司),兔抗山羊HRP標記的IgG二抗,山羊抗兔HRP標記的IgG二抗,山羊抗小鼠HRP標記的IgG二抗(北京中山生物技術(shù)公司)。
　　 (三)主要儀器
　　 細胞培養(yǎng)箱(美國Formascientific公司

8、);超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);倒置顯微鏡(日本TMS公司);紫外-可見光分光光度計(日本島津公司);BDFACSCalibur流式細胞儀(美國Becton-Dickinson公司);超聲粉碎機(德國Dr.Hielscher公司);臺式低溫超速離心機(德國Sigma公司);聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置(美國Bio-Rad公司);轉(zhuǎn)印儀(北京市六一儀器廠);Las3000成像系統(tǒng)(日本FUJIFILM公司);凝膠成像分析軟件(江蘇捷

9、達科技有限公司);電子分析天平(德國Sartorius公司);-80℃超低溫冰箱(日本SANYO公司);恒溫震蕩水浴(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司);旋渦混合器(上海醫(yī)科大學儀器廠)。
　　 二、實驗方法
　　 (一)細胞培養(yǎng)
　　 (二)實驗分組
　　 1、Artemether對U87細胞增殖、遷移和侵襲的影響
　　 (1)0μmol/l組:U87細胞+正常培養(yǎng)液
　　 (2)150

10、μmol/l組:U87細胞+Artemether(150μmol/l)
　　 (3)300μmol/l組:U87細胞+Artemether(300μmol/l)
　　 (4)600μmol/l組:U87細胞+Artemether(600μmol/l)
　　 2、驗證shRNA-VCAM1的沉默效率
　　 (1)Blank:U87細胞
　　 (2)NC:U87細胞轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒
　　 (3)s

11、hRNA-VCAM1:U87細胞轉(zhuǎn)染沉默VCAM1質(zhì)粒
　　 3、Artemether與shRNA-VCAM1聯(lián)合應用對U87細胞增殖、遷移和侵襲的影響
　　 (1)Control組:U87細胞
　　 (2)Artemether組:U87細胞+Artemether(300μmol/l)
　　 (3)shRNA-VCAM1組:U87細胞轉(zhuǎn)染沉默VCAM1質(zhì)粒
　　 (4)shRNA-VCAM1+Ar

12、temether組:轉(zhuǎn)染沉默VCAM1質(zhì)粒的U87細胞+Artemether(3001μmol/l)
　　 (三)細胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染及擴大培養(yǎng)
　　 (四)MTT法測定細胞增殖活性。
　　 (五)劃痕試驗觀察細胞遷移能力。
　　 (六)Transwell侵襲實驗測定細胞侵襲能力。
　　 (七)細胞凋亡AnnexinV-FITC/PI檢測
　　 (八)WesternBlot方法檢測P-Akt,M

13、MP2,MMP9的變化
　　 (九)統(tǒng)計學處理
　　 所有數(shù)值以均數(shù)±標準差(-X±SD)表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析,兩兩比較采用t檢驗,組間比較采用單因素方差分析(Bonferroni檢驗),P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 實驗結(jié)果：
　　 一、Artemether抑制U87細胞的增殖
　　 不同濃度的Artemether作用于U87細胞,Artemether以

14、劑量依賴方式抑制細胞生長:與0μmol/l相比,作用時間為48小時及72小時的400μmol/l,600μmol/l,800μmol/l,1000μmol/l的Artemether顯著抑制細胞生長,作用時間為24小時的IC50為948.47±10.2pmol/l,48小時的IC50為354.81±13.8μmol/l,72小時的IC50為275.42±9.5μmol/l。Artemether作用48h后顯著抑制細胞生長,而72h與48h

15、相比沒有明顯變化。因此,48h作為最長給藥時間,進行后續(xù)試驗。
　　 二、Artemether抑制U87細胞的遷移能力
　　 濃度分別為0μmol/l,150μmol/l,300μmol/l,600μmol/l的Artemether作用于U87細胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著Artemether濃度升高,U87細胞的遷移能力逐漸降低。
　　 三、Artemether抑制U87細胞的侵襲能力
　　 濃度分別為0μmol/

16、l,150μmol/l,300μmol/l,600μmol/l的Artemether作用于U87細胞48h后,各組穿過8μm含BD基質(zhì)膠的Transwell小室的細胞個數(shù)分別是78.5±3.5個,71.7±1.2個,54.7±1.2個,22.3±2.1個。與0μmol/l組相比150μmol/l、300μmol/l和600μmol/l的Artemether分別使U87細胞的侵襲能力顯著降低(P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01)。<

17、br>　　 四、Artemether促進U87細胞的凋亡
　　 濃度分別為0μmol/l,150μmol/l,300μmol/l,600μmol/l的Artemether作用于U87細胞48h后,應用AnnexinV-FITC/PI雙標記法檢測細胞凋亡。各組凋亡率分別為4.77±0.62%,9.28±0.71%,15.11±1.05%,22.70±0.92%。與0μmol/l組相比150μmol/l,300μmol/l和600

18、μmol/l的Artemether顯著促進U87細胞的凋亡(P＜0.01)。
　　 五、Artemether降低U87細胞的MMP2、MMP9蛋白表達
　　 不同濃度的Artemether作用U87細胞48h后,WesternBlot結(jié)果顯示,與0μmol/l組相比,150μmol/l,300μmol/l和600μmol/l的Artemether分別顯著降低MMP2、MMP9蛋白表達水平(P＜0.01)。
　　

19、六、Artemether降低U87細胞p-Akt/Akt的蛋白表達
　　 不同濃度的Artemether作用U87細胞48h后,WesternBlot結(jié)果顯示,與0μmol/l組相比,300μmol/l和600μmol/l組分別顯著降低p-Akt/Akt蛋白表達水平(P＜0.05,P＜0.01)。
　　 七、Artemether降低U87細胞VCAM1的蛋白表達
　　 不同濃度的Artemether作用U87細胞

20、48h后,WesternBlot結(jié)果顯示,與0μmol/l組相比,300μmol/l、600μmol/l的Artemether分別顯著降低VCAM1蛋白表達水平(p＜0.05)。
　　 八、驗證shRNA-VCAM1的沉默效率
　　 應用RNA干擾沉默VCAM1的U87細胞,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后,WesternBlot結(jié)果顯示,與blank組相比,VCAM1的表達顯著降低,NC對照組無明顯變化,沉默效率達到70%。
　　

21、九、Artemether與shRNA-VCAM1聯(lián)合應用抑制U87細胞的遷移
　　 濃度為300μmol/l的Artemether與shRNA-VCAM1聯(lián)合作用于U87細胞,細胞劃痕試驗觀察對U87細胞遷移能力變化,Artemether組、shRNA-VCAM1組和shRNA-VCAMl+Artemether組分別抑制了U87細胞的遷移能力,shRNA-VCAMl+Artemether組效果更明顯。
　　 十、Arte

22、mether與shRNA-VCAM1聯(lián)合應用抑制U87細胞的侵襲
　　 濃度為300μmol/l的Artemether與shRNA-VCAM1聯(lián)合作用于U87細胞,Transwell侵襲實驗檢測U87細胞侵襲能力變化。Control組穿過Transwell小室的細胞個數(shù)為79.67±2.08個,Artemether組為57±2.65個,shRNA-VCAM1組為46±1個,shRNA-VCAM1+Artemether組為18.3

23、3±1.53個。與Control組相比,Artemether組、shRNA-VCAM1組和shRNA-VCAM1+Artemether組分別使U87細胞侵襲力降低,與Artemether組或shRNA-VCAM1組相比,shRNA-VCAM1+Artemether組分別顯著降低了U87細胞的侵襲能力(P＜0.01)。
　　 十一、Artemether與shRNA-VCAM1聯(lián)合應用促進U87細胞凋亡
　　 濃度為300μ

24、mol/l的Artemether與shRNA-VCAM1聯(lián)合作用于U87細胞,AnnexinV-FITC/PI染色方法檢測U87細胞凋亡情況,U87組凋亡率為4.89±0.58%,Artemether組為17.66±1.12%,shRNA-VCAM1組為10.97±0.62%,shRNA-VCAM1+Artemether組為40.04±1.11%。與Control組相比,Artemether組,shRNA-vCAM1組,shRNA-VC

25、AM1+Artemether組均顯著促進U87細胞的凋亡,而與Artemether組或shRNA-VCAM1組相比,shRNA-VCAM1+Artemether組顯著促進了U87細胞的凋亡(P＜0.01)。
　　 十二、Artemether與shRNA-VCAM1聯(lián)合應用降低U87細胞MMP2、MMP9的蛋白表達
　　 Artemether聯(lián)合沉默VCAM1共同作用U87細胞48h后,WesternBlot結(jié)果顯示,與C

26、ontrol組相比,Artemether組,shRNA-VCAM1組,shRNA-VCAM1+Artemether組均顯著降低MMP2、MMP9蛋白的表達(P＜0.01),與Artemether組或shRNA-VCAM1組相比,shRNA-VCAM1+Artemether組分別顯著降低了MMP2、MMP9蛋白的表達(P＜0.05)。
　　 十三、Artemether與shRNA-VCAM1聯(lián)合應用降低U87細胞p-Akt/Akt

27、蛋白表達
　　 聯(lián)合應用Artemether和shRNA-VCAM1,作用U87細胞48h后,應用WesternBlot方法檢測p-Akt/Akt蛋白的表達。與Control組相比,Artemether組、shRNA-VCAM1+Artemether組分別顯著降低p-Akt/Akt蛋白表達(P＜0.01)。與Control組相比,shRNA-VCAM1組對p-Akt/Akt蛋白表達未有統(tǒng)計學意義的影響(P＞0.05)。與Arte

28、mether組相比,shRNA-VCAM1+Artemether組顯著降低了p-Akt/Akt蛋白表達(P＜0.05)。與shRNA-VCAMl組相比,shRNA-VCAMl+Artemether組顯著降低了p-Akt/Akt蛋白表達(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1、Artemether以劑量依賴方式顯著抑制人腦膠質(zhì)瘤U87細胞的遷移、侵襲,并促進U87細胞的凋亡,上述作用與Arternether降低VCAM1