CHB患者外周血Th17-IL-17表達水平與疾病的關系.pdf

1、本研究采集我院感染性疾病科93例CHB患者(其中CHB患者輕度21例,中度37例,重度35例)及28例健康體檢者外周血各7ml,通過檢測不同疾病程度CHB患者組與正常對照組外周血中CD4+T細胞IL-17的表達,及與Th17細胞分化相關的細胞因子的表達情況,并分析其表達與肝臟損傷標志物的關系,從而進一步探討Th17細胞與CHB患者肝臟病理損傷所可能存在的關系。 首先,我們主要采用三種研究方法對疾病組和健康對照組外周血Th17細胞

2、/IL-17的表達水平進行檢測。采用的檢測方法主要包括流式細胞術(FACS)、熒光實時定量聚合酶鏈反應(Real time PCR)和酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)。 1、流式細胞術檢測各組外周血Th17細胞的表達。我們取各組EDTA抗凝全血100μl,用100μl含10％小牛血清1640培養(yǎng)基稀釋后,同時加入50ng/ml PMA、1μg/mlIonomycin和1μg/ml Golgi plug,37度5％CO2孵箱刺激培養(yǎng)

3、5h后標記抗人CD4流式抗體,隨后按照BD公司流式穿膜試劑盒操作步驟對細胞內細胞因子IL-17、IFN-γ染色,并進行流式細胞儀檢測。結果提示：與正常對照組相比,中重度CHB患者組外周血CD4+IFN-γ-IL-17+T細胞(Th17細胞)比例均明顯升高(P<0.05),而中度與輕度組、輕度與正常對照組間差異不明顯；各組之間CD4+IFN-γ+IL-17T細胞(Th1細胞)比例無明顯區(qū)別。重度CHB患者CD4+IFN-γIL-17+T細

4、胞比例雖高于正常對照,但差異統(tǒng)計學上無顯著意義。 2、Real time PCR方法檢測各組外周血CD4+T細胞內IL-17及Th17細胞分化重要轉錄因子RORγt的mRNA表達水平。我們利用外周血CD4+T細胞富集試劑盒和淋巴細胞分離液分離出各組外周血CD4+T細胞,在不經任何刺激培養(yǎng)和經抗人CD3抗體及PMA刺激4h的情況下分別對各組CD4+T細胞通過Real time PCR技術進行IL-17、RORγt mRNA水平的定

5、量檢測。結果顯示：經過刺激培養(yǎng)后,重度CHB患者組IL-17、RORγt的mRNA表達水平高于輕度組和正常對照組(P<0.05),且IL-17的mRNA表達在中度與正常對照組間也有差異,但重度與中度組間,輕度與正常對照組間的差異無統(tǒng)計學意義。 3、ELISA方法檢測外周血血清及CD4+T細胞培養(yǎng)上清IL-17的表達。我們對各組外周血血清及經抗人CD3抗體及抗人CD28抗體刺激72h后的CD4+T細胞培養(yǎng)上清行IL-17 ELIS

6、A檢測以進一步驗證上述結果。我們發(fā)現(xiàn),與流式細胞儀和Real timePCR檢測結果類似的是：經刺激培養(yǎng)后重度CHB患者組培養(yǎng)上清IL-17表達水平高于中度、輕度和正常對照組(P<0.05);雖然中度組較輕度和正常對照組而言也升高,但變化無統(tǒng)計學意義；輕度組和正常對照組間仍無差別。而外周血血清IL-17的表達各組間差異不明顯。其次,由于以上結果均支持中重度CHB患者體內存在著Th17細胞的高表達,因此我們運用Real time PCR技

7、術進一步分析了目前認為和IL-17共表達于Th17細胞的細胞因子IL-22,以及促進Th細胞向Th17細胞分化的相關細胞因子TGF-β、IL-6、IL-1β在各組外周血CD4+T細胞的mRNA表達情況。 結果發(fā)現(xiàn)：重度CHB患者組CD4+T細胞表達TGF-β、IL-6、IL-1β均高于正常對照組,但差異無統(tǒng)計學意義。當我們將分離出的CD4+T細胞經抗人CD3抗體及PMA刺激4h后,再對上述細胞因子進行檢測后結果顯示：重度CHB患

8、者組TGF-β、IL-1β表達水平與中度、輕度、正常對照組之間的差異較未經刺激時明顯增大,具統(tǒng)計學意義(P<0.05),其余各組間的差異不顯著；重度組IL-6的表達水平較正常對照組相比也明顯升高。而IL-22的表達水平在刺激前后各組間變化均不明顯。 最后,對以上結果進行分析后我們認為CHB患者體內存在著Th17細胞及其分化相關因子的高表達,值得我們進一步研究其免疫功能與疾病之間可能存在的相互關系。因此,我們進一步對CHB患者組外

9、周血血清HBV DNA載量、肝臟損傷標志物ALT進行檢測,并由此分析外周血Th17細胞所占CD4+T細胞比例與患者外周血血清ALT表達水平、HBV DNA載量之間是否存在一定相關性。研究發(fā)現(xiàn)疾病組外周血Th17細胞所占比例與其血清ALT水平成正相關(P<0.01),而與HBV DNA載量無明顯相關性。 本研究中,我們首先運用了三種檢測方法對疾病組和健康對照組外周血Th17細胞/IL-l7的表達水平進行了反復檢測和驗證。我們的研究

10、結果提示：隨著CHB患者疾病嚴重程度的加大,外周血CD4+IFN-γ-IL-17+T細胞(Th17細胞)所占的比例、經抗人CD3抗體及PMA刺激4h后的CD4+T細胞內IL-17、RORγt的mRNA表達水平、經抗人CD3抗體及抗人CD28抗體刺激72h后的CD4+T細胞培養(yǎng)上清IL-17的表達水平均明顯上調。隨后,當我們進一步分析與Th17細胞分化相關的細胞因子TGF-β、lL-6、IL-1β以及共表達于Th17細胞內的細胞因子IL-

11、22在外周血CD4+T細胞內的mRNA表達水平時發(fā)現(xiàn)：在經過抗人CD3抗體及PMA刺激4h后,重度CHB患者組TGF-β、IL-6、IL-1β表達水平高于正常對照組,而IL-22的表達水平無明顯變化。 最后,我們進一步研究Th17細胞與CHB患者HBV載量和肝臟損傷的關系時,我們發(fā)現(xiàn)患者組外周血Th17細胞所占比例與其血清ALT水平呈正相關(P<0.01),而與HBV DNA載量無明顯相關性。本研究提示Th17細胞可能在參與CH

12、B疾病的病程進展及肝臟損傷中發(fā)揮一定作用。雖然,疾病各組間及輕度與正常對照組之間的差異統(tǒng)計學上無顯著意義(這一現(xiàn)象可能在進一步擴大病例數(shù)后得到解決),但從整體趨勢上來看,外周血Th17細胞所占比例、CD4+T細胞刺激培養(yǎng)上清IL-17的表達水平及IL-17、RORγt的mRNA表達水平均隨疾病加重而升高。由于TGF-β、IL-6、IL-1β為促進Tn17細胞分化的重要細胞因子,與此相符的是,我們在研究中也發(fā)現(xiàn)重度CHB患者外周血刺激培養(yǎng)

13、的CD4+T細胞存在著上述細胞因子的高表達。同時,業(yè)已有大量文獻報道CHB患者外周血血清存在著TGF-β、IL-1β等細胞因子的表達上調,但我們所觀察到的CHB患者外周血Th17細胞表達水平的升高是否與此直接相關還值得進一步證實。在本實驗研究中,無論是對外周血血清直接檢測IL-17,還是對分離出的未經體外刺激的CD4+T細胞直接檢測細胞因子的mRNA表達水平,我們都沒有檢測到疾病組與對照組間統(tǒng)計學意義上的差別；但在經過體外刺激培養(yǎng)后這一

14、差異有了明顯的提高,且達到了統(tǒng)計學意義上的區(qū)別。由于報道認為HBV感染后發(fā)生慢性乙型肝炎時,機體的免疫反應很弱,并不能檢測到特異性的T細胞反應。 另外,近來的研究報道認為Th17細胞在高表達IL-17的同時,也表現(xiàn)出產生大量的IL22。然而,與IL-17共表達于Th17細胞的細胞因子IL-22在本研究中并未呈現(xiàn)出與IL-17相應的變化趨勢,這一現(xiàn)象目前我們并不能很好的解釋。最近也有研究提出體內可能存在著另一群Th17細胞,它們并

15、不高表達IL-22,而主要高表達IL-17。因此,是否我們所發(fā)現(xiàn)的這群在CHB患者外周血增高的Th17細胞主要為這樣一群細胞?在本研究中這一群僅主要高表達IL-17的CD4+T細胞在CHB患者外周血出現(xiàn)了明顯升高,且隨患者疾病程度的加重而增加。然而,這樣一群主要高表達IL-17的CD4+T細胞-Th17細胞在CHB疾病進展中具體致病性如何?在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)CHB患者外周血Th17細胞占CD4+T細胞的比例與患者肝臟損傷指標-ALT的

16、表達呈明顯正相關,這一現(xiàn)象提示我們Th17細胞在CHB患者肝臟損傷方面發(fā)揮重要作用。另外,Th17細胞占CD4+T細胞的比例與HBV病毒載量無明顯相關性,這也提示我們可能Th17細胞的多少與病毒含量直接聯(lián)系并不大,而與病毒感染后引起的免疫反應或者組織損傷有關。但是,Th17細胞和IL-17在CHB患者體內的表達上調及其與ALT表達的正相關性是由于HBV這樣一種病毒感染機體后所直接引起還是由于肝臟損傷之后所間接引起的還值得我們進一步研究證

17、實。 CHB的發(fā)病與多種因素相關,病毒成分、肝臟損傷以及機體免疫系統(tǒng)的相互作用在疾病的持續(xù)性發(fā)展過程中扮演重要角色。CHB的治療應包括抗病毒、免疫調節(jié)、改善肝功能和抗肝纖維化。一般認為乙型肝炎病毒本身致病性有限,機體在清除病毒的過程中造成的免疫損害是造成肝臟病變的原因。但是在疾病的自然發(fā)展及抗病毒藥物清除病毒的過程均可發(fā)現(xiàn)病毒水平和人體免疫力有相關性?？祻蜁r,先出現(xiàn)病毒下降,再出現(xiàn)臨床病情緩解；病情復發(fā)時,則出現(xiàn)病毒水平上升,然后出現(xiàn)病