三氧化二砷對哮喘小鼠Th17-IL-17軸的影響及機制.pdf

1、背景:支氣管哮喘是一種與免疫功能紊亂有關(guān)的慢性氣道炎癥性疾病，“Th1/Th2失衡，Th2優(yōu)勢分化”的理論在哮喘發(fā)病機制方面一直占主導(dǎo)地位。Th17細(xì)胞是新近發(fā)現(xiàn)的又一類CD4+T細(xì)胞亞群，主要通過其分泌的IL-17起作用。最新研究顯示Th17/IL-17也參與了哮喘的發(fā)生、發(fā)展，可能是哮喘難治的重要原因。三氧化二砷(ATO)是一種古老而神奇的中藥，中醫(yī)實踐表明它具有良好的平喘作用，但其作用機制尚不清楚。三氧化二砷的平喘作用是否與抑制哮

2、喘Th17/IL-17的表達(dá)有關(guān)?機制又是什么?目前未見報道。
　　 目的:觀察三氧化二砷的平喘作用及對Th17細(xì)胞、IL-17表達(dá)的影響，并與地塞米松的作用比較，初步探討其治療支氣管哮喘的作用是否與通過線粒體相關(guān)途徑誘導(dǎo)哮喘CD4+T細(xì)胞凋亡有關(guān)。
　　 方法:①40只SPF級雌性BALB/c小鼠隨機分為4組:正常組(PBS/PBS)、哮喘組(OVA/PBS)、ATO干預(yù)組(OVA/ATO)、DXM干預(yù)組(OVA/DX

3、M)，以O(shè)VA致敏、激發(fā)建立哮喘模型，末次激發(fā)24h后處理小鼠。對小鼠進(jìn)行行為學(xué)觀察，檢測氣道反應(yīng)性，肺組織病理切片觀察炎癥浸潤及黏液分泌，收集BALF行細(xì)胞學(xué)分類、計數(shù)，檢測BALF中IL-17的濃度。②研磨各組小鼠脾臟，制備單個核細(xì)胞懸液，免疫磁珠分離脾臟CD4+T細(xì)胞，計算每組小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞總數(shù)，判斷細(xì)胞活力，流式儀檢測各組小鼠Th17細(xì)胞陽性率。③將免疫磁珠分離的哮喘組脾臟CD4+T細(xì)胞分成3組:哮喘CD4+T細(xì)胞原液

4、組(OVA)、哮喘CD4+T細(xì)胞+ATO組(OVA/ATO)、哮喘CD4+T細(xì)胞+DXM組(OVA/DXM)，干預(yù)、培養(yǎng)20h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測上述3組CD4+T細(xì)胞的早期凋亡率，比較哮喘CD4+T細(xì)胞原液組(OVA)、哮喘CD4+T細(xì)胞+ATO組(OVA/ATO)的線粒體膜電位、胞內(nèi)Ca2+濃度，ELISA檢測哮喘CD4+T細(xì)胞原液組(OVA)、哮喘CD4+T細(xì)胞+ATO組(OVA/ATO)培養(yǎng)上清液中的IL-17含量。④對哮喘小鼠脾

5、臟Th17細(xì)胞陽性率與中性粒細(xì)胞數(shù)、哮喘小鼠BLAF中IL-17濃度與中性粒細(xì)胞數(shù)、哮喘CD4+T細(xì)胞+ATO組CD4＋T細(xì)胞早期凋亡率與其培養(yǎng)上清液中的IL-17含量進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　 結(jié)果:
　　 (1)哮喘組小鼠出現(xiàn)典型的哮喘樣癥狀，ATO和DXM干預(yù)組小鼠癥狀有所減輕，而正常組小鼠表現(xiàn)正常；
　　 (2)與正常組相比，哮喘組氣道反應(yīng)性明顯增高（P＜0.05）；而與哮喘組相比，ATO干預(yù)組和DXM干預(yù)組

6、氣道反應(yīng)性均有所降低（均P＜0.01），并且兩組間沒有顯著差異（P＞0.05）；
　　 (3)與正常組相比，哮喘組肺部大量炎癥細(xì)胞浸潤、杯狀細(xì)胞增生、氣道黏液高分泌（均P＜0.01），而ATO和DXM干預(yù)組氣道炎癥和黏液高分泌均有所緩解（均P＜0.01），并且兩組間沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；
　　 (4)與正常組相比，哮喘組BALF中白細(xì)胞總數(shù)、Eos、Lym、Neu均顯著升高（均P＜0.01），而ATO和DXM干

7、預(yù)組白細(xì)胞總數(shù)、Eos、Lym、Neu均有所降低（均P＜0.05），但在抑制Neu方面ATO較DXM強（P＜0.01）；
　　 (5)與正常組相比，哮喘組BALF中IL-17的濃度顯著增高（P＜0.01），而ATO和DXM干預(yù)組BALF中IL-17的濃度均有所降低（均P＜0.01），并且兩組間沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；
　　 (6)與正常組相比，哮喘組小鼠脾臟中CD4+T細(xì)胞數(shù)量明顯增多(P＜0.01)；而與哮喘組

8、相比，ATO和DXM干預(yù)組脾臟CD4+T細(xì)胞數(shù)量均明顯減少（均P＜0.01），并且兩組間沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；
　　 (7)與正常組相比，哮喘組小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞中Th17細(xì)胞陽性率顯著增加（P＜0.01），而ATO和DXM干預(yù)組Th17細(xì)胞陽性率有所降低（均P＜0.01），并且兩組間沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；
　　 (8)與哮喘CD4＋T細(xì)胞原液組相比，哮喘CD4+T細(xì)胞+ATO組、哮喘CD4＋T

9、細(xì)胞+DXM組CD4+T細(xì)胞的早期凋亡率均顯著升高（P＜0.01），并且兩組間沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；
　　 (9)與哮喘CD4+T細(xì)胞原液組相比，哮喘CD4+T細(xì)胞+ATO組線粒體膜電位明顯下降（P＜0.05）；
　　 (10)與哮喘CD4+T細(xì)胞原液組相比，哮喘CD4+T細(xì)胞+ATO組細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯增高（P＜0.01）；
　　 (11)與哮喘CD4+T細(xì)胞原液組相比，哮喘CD4+T細(xì)胞+ATO

10、組培養(yǎng)上清液中的IL-17含量明顯下降（P＜0.01）；
　　 (12)哮喘小鼠脾臟Th17細(xì)胞陽性率與BALF中中性粒細(xì)胞數(shù)呈顯著正相關(guān)(r=0.998，P＜0.05)；
　　 (13)哮喘小鼠BLAF中IL-17濃度與中性粒細(xì)胞數(shù)呈顯著正相關(guān)(r=0.982，P＜0.05)；
　　 (14)哮喘CD4+T細(xì)胞+ATO組CD4+T細(xì)胞早期凋亡率與其培養(yǎng)上清液中的IL-17含量呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.956，P＜

11、0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 (1)本實驗中建立的哮喘小鼠模型是成功的，Th17/IL-17軸參與了哮喘的發(fā)病過程；
　　 (2)ATO有治療哮喘，尤其是中性粒細(xì)胞引起的非EOS性哮喘的潛在價值；
　　 (3)ATO能起到良好的的平喘作用，這可能與其抑制哮喘Th17/IL-17軸的表達(dá)有關(guān)；
　　 (4)通過線粒體相關(guān)途徑誘導(dǎo)哮喘CD4+T細(xì)胞凋亡，可能是ATO抑制哮喘Th17/IL-17軸表