Th17-IL-17在兒童哮喘發(fā)病中的作用研究.pdf

1、第一部分哮喘兒童外周血Th17水平及其表達(dá)IL-17功能研究 第一節(jié)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人Th17細(xì)胞方法探討 目的：探討流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人Th17細(xì)胞方法。 方法：收集健康兒童外周血，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），使用不同劑量PMA、不同刺激培養(yǎng)時(shí)間處理后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17細(xì)胞百分率，檢測(cè)早期活化標(biāo)記細(xì)胞膜CD69以及表達(dá)IFN-γ的Th1細(xì)胞作為細(xì)胞活化的參照，獲得最佳刺激劑量和培養(yǎng)時(shí)間。 結(jié)果：T

2、h17與Th1的活化條件不相同，PMA10-100μg/L加上Ionomycin和高爾基體阻斷劑，培養(yǎng)4-12 h以內(nèi)可獲得Th17較好檢測(cè)結(jié)果，過(guò)高的刺激劑量以及培養(yǎng)時(shí)間不能提高檢測(cè)水平反而影響Th17的檢測(cè)。 結(jié)論：本研究探討的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人Th17的方法指導(dǎo)臨床和科學(xué)研究。 第二節(jié)哮喘兒童外周血Th17水平及表達(dá)IL-17功能研究 目的：觀察哮喘急性發(fā)作期患兒外周血Th17水平和功能狀態(tài)，初步探討Th17

3、在兒童哮喘發(fā)病中的作用。 方法：以正常兒童（對(duì)照組，n=20）為對(duì)照，流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)哮喘急性發(fā)作期患兒（哮喘組，n=30）外周血Th17以及Th1，Th2細(xì)胞百分率，Q-PCR方法檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）IL-17 mRNA的表達(dá)，ELISA方法檢測(cè)體外培養(yǎng)上清IL-17，IFN-γ以及血漿IL-17，IL-23，IgE水平。 結(jié)果：（1）哮喘組和對(duì)照組外周血CD4+T中CD4+IL-17+T百分率[（

4、1.25±0.66）％vs（1.27±0.66）％（P>0.05）]；CD4+IL-4+T比例[（2.40±2.55）％vs（2.52±1.26）％（P>0.05）]；兩組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。哮喘組CD4+IFN-γ+T比例顯著低于對(duì)照組[15.79±7.48 vs24.10±12.70（P<0.05）]。（2）哮喘組PBMC表達(dá)IL-17 mRNA顯著低于對(duì)照組（8.26（4.40-49.43）vs4.78（1.0-35.49）Z=1.

5、93 P=0.05）；PHA刺激PBMC體外培養(yǎng)72 h上清中，哮喘組IL-17水平顯著低于對(duì)照組[17.53（0～245.57）ng/L vs101.74（25.12～500.60）ng/L（P<0.01）]；IL-17 mRNA與蛋白水平呈正相關(guān)（r=0.76 P=0.01）。IFN-γ水平與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[3507±2788 ng/L vs3027±2737 ng/L]；兩組血漿中IL-17均<2ng/L，IL-23均<1

6、5 ng/L。（3）哮喘組血漿總IgE499.26（2.3～945.1）IU/mL，顯著高于對(duì)照組54.57（1.7～318.26）IU/mL（P<0.001）；IgE陽(yáng)性（>150 IU/mL）和陰性（<150 IU/mL）哮喘患兒體外PBMC培養(yǎng)上清中IL-17，IFN-γ水平比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：哮喘急性發(fā)作期患兒外周血Th1細(xì)胞以及PHA活化的IL-17表達(dá)水平降低，Th1水平和Th17功能異常的機(jī)制及其在兒童哮喘發(fā)

7、病中的作用值得進(jìn)一步研究。 第二部分 IL-17 G-152A基因多態(tài)性與兒童哮喘發(fā)病相關(guān)性研究 目的：分析中國(guó)西南地區(qū)漢族人群IL-17 G-152A多態(tài)性（rs2275913）與兒童哮喘發(fā)病的相關(guān)性。 方法：采用PCR-限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性（Restricion Fragment Length Polymorphism，RFLP）法分析88例哮喘患兒（哮喘組，其中51例為變應(yīng)性哮喘），89例毛細(xì)支氣管炎患兒（

8、毛細(xì)支氣管炎組）和184例健康對(duì)照（對(duì)照組）IL-17 G-152A位點(diǎn)基因型。ELISA法檢測(cè)PHA誘導(dǎo)不同基因型PBMC表達(dá)IL-17水平。比較不同基因型哮喘患兒血清總IgE、肺功能及毛細(xì)支氣管炎患兒臨床特點(diǎn)。 結(jié)果：（1）IL-17 G-152A位點(diǎn)在中國(guó)西南地區(qū)存在多態(tài)性，各組基因型頻率符合Hardy-Weinberg平衡。健康人群A、G等位基因頻率分別41.6％、58.4％；AA、AG和GG基因型頻率分別14.7％、5

9、3.8％、31.5％（2）哮喘組G-152A位點(diǎn)等位基因以及基因型頻率與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，OR值及95％CI在A等位基因?yàn)?.44（1.00-2.06），P=0.048；在AA基因型為2.44（1.32-4.50），P=0.004。相對(duì)于變應(yīng)性哮喘，A等位基因和AA基因型顯示更高的OR值。（3）基礎(chǔ)肺功能，血清總IgE平均水平在各基因型組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但AA基因型中血清總IgE增高（>150 IU/mL）個(gè)體及肺功能FV

10、C、FEV1降低（<80％個(gè)人預(yù)測(cè)值）個(gè)體的比例顯著高于AG和GG基因型（P<0.05）。（4）PHA誘導(dǎo)的PBMC表達(dá)IL-17水平在各基因型組無(wú)顯著差異（5）毛細(xì)支氣管炎組基因型和等位基因頻率與正常組或哮喘組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；結(jié)合臨床資料分析顯示AA基因型患兒鼻咽部肺炎鏈球菌檢出率較高（37.5％ vs2.5％，P=0.001）；AA基因型患兒住院時(shí)間較長(zhǎng)（8.89±1.76 vs7.15±2.05，P=0.02），GG基因型喘息病

11、程較短（9.85±3.36 vs11.64±2.64，P=0.03）. 結(jié)論：本研究在基因水平提示IL-17與哮喘發(fā)病有關(guān)。IL-17 G-152A多態(tài)性（rs2275913）是中國(guó)西南地區(qū)兒童變應(yīng)性哮喘發(fā)病的危險(xiǎn)因素，AA基因型與哮喘患兒血清總IgE升高以及肺功能FVC、FEV1異常有關(guān)。在毛細(xì)支氣管炎患兒中發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)不同基因型間臨床表現(xiàn)存在差異，可能與發(fā)生哮喘有關(guān)。有待增加樣本量，以及進(jìn)一步探討IL-17G-152A多態(tài)性對(duì)