人胚胎生殖細胞的原代、傳代培養(yǎng)及生物學鑒定.pdf

1、目的：鑒定組織塊培養(yǎng)法體外培養(yǎng)人胚胎生殖腺嵴和背側腸系膜所獲得的細胞為未分化的人胚胎生殖細胞(人EG細胞)；嘗試不同時間和不同方法對人EG細胞進行傳代培養(yǎng)，探討最佳傳代時機和傳代方法；并確定傳代培養(yǎng)的細胞仍為未分化的人EG細胞。 方法：取5～10周人胚胎生殖腺嵴和背側腸系膜，用源于自身胚胎組織的成纖維細胞作為飼養(yǎng)層，在不添加任何細胞因子條件下進行組織塊培養(yǎng)。以免疫細胞化學法檢測培養(yǎng)細胞中SSEA．1、SSEA-3、Oct-4、端

2、粒酶的表達；利用流式細胞術檢測所得細胞中人EG細胞的比例。對原代培養(yǎng)第八天和第16天的細胞采用挑出傳代法、消化傳代法傳代培養(yǎng)，其中消化傳代法使用的三種消化液分別是0．25％胰蛋白酶、0．5％胰蛋白酶和0．25％胰蛋白酶-0．02％EDTA。檢測傳代培養(yǎng)后細胞中SSEA-1、SSEA-3、Oct-4、端粒酶的表達。 結果：原代培養(yǎng)的細胞生長良好，免疫細胞化學檢測顯示，位于飼養(yǎng)層上的細胞及細胞集落陽性表達SSEA-1、SSEA-3、

3、Oct-4、端粒酶；流式細胞術檢測表明，培養(yǎng)體系中人EG細胞比例約為13％。原代培養(yǎng)至第八天時，細胞生長最旺盛，適合于傳代；第16天時，很多人EG細胞集落已分化或消散，喪失了傳代的能力。使用胰蛋白酶-EDTA作為消化液消化傳代人EG細胞所得的集落最多，效果最佳。通過免疫細胞化學方法檢測表明，傳代培養(yǎng)第五代細胞仍保持SSEA．1、SSEA-3、Oct-4、端粒酶的陽性表達。 結論：組織塊培養(yǎng)法原代培養(yǎng)人胚胎生殖腺嵴和背側腸系膜所獲