水牛胚胎生殖樣細(xì)胞分離培養(yǎng)及相關(guān)研究.pdf

1、本文重點(diǎn)進(jìn)行了如下四個(gè)方面的研究： 1.從形態(tài)觀察、堿性磷酸酶染色、表面抗原的免疫組化檢測(cè)、多能性的標(biāo)志基因表達(dá)和體外分化潛能等方面對(duì)水牛胚胎生殖樣細(xì)胞(EG-likecells)的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水牛EG樣細(xì)胞形成多層結(jié)構(gòu)的克隆，有明顯的邊界與飼養(yǎng)層分開，與小鼠的ES/EG克隆形態(tài)相似。通過組化染色發(fā)現(xiàn)，水牛EG樣細(xì)胞表達(dá)AP、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4以及OCT-4。另外，RT-PCR結(jié)果顯示，

2、Fgf4除外，水牛EG樣細(xì)胞均表達(dá)OCT-4、NANOG、SOX2、FOXD3、GP130、STAT3和HEB基因。將細(xì)胞延遲培養(yǎng)2個(gè)星期后，可以觀察到成纖維樣細(xì)胞，神經(jīng)樣細(xì)胞，肌樣細(xì)胞和上皮樣細(xì)胞的分化形成。懸浮培養(yǎng)的水牛EG樣細(xì)胞可以形成簡單擬胚體和復(fù)雜擬胚體(EB)，復(fù)雜擬胚體仍然表達(dá)FOXD3、GP130、STAT3以及HEB基因，但已經(jīng)無法檢測(cè)出OCT-4、NANOG和SOX2這三個(gè)基因。此外，三個(gè)胚層標(biāo)志基因的表達(dá)也在復(fù)雜擬

3、胚體檢測(cè)出來，分別是內(nèi)胚層KERATIN-14(Endoderm)，中胚層GATA4、ACTA2(Mesoderm)以及外胚層TUBB3(Ectoderm)，表明這些水牛EG樣細(xì)胞可在體外分化形成三個(gè)胚層。以上結(jié)果表明，水牛EG樣細(xì)胞具有與人和小鼠ES/EG相似的生物學(xué)特性。 2.探討了水牛EG樣細(xì)胞分離培養(yǎng)及傳代的影響因素(性別、胎齡、分離方法、飼養(yǎng)層及細(xì)胞因子)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雄性胎牛組的單位胎?？寺?shù)和克隆直徑都顯著高于雌性胎

4、牛組(5.77±6.34 vs 1.03±2.64；227.76±83.84vs.102.34±40.59，P<0.05)。80～90 dpc胎牛組的單位胎牛原代克隆形成數(shù)為1.60±2.63個(gè)，顯著低于其他各組(P<0.05)，其形成的克隆直徑(190.63±65.11)，也顯著低于除70～80 dpc組以外的其他各組(P<0.05)，并且80～90 dpc組的最高傳代數(shù)僅為3代，而其他各組都達(dá)到或超過了6代。對(duì)于單位胎牛原代克隆形成

5、數(shù)和克隆直徑，機(jī)械組都顯著高于胰酶消化組(8.087±6.935 vs 1.765±4.747；216.95±77.41 vs140±38.76，P<0.05)。 BEF飼養(yǎng)層組的各代克隆形成數(shù)都顯著高于其它各組(P<0.05)，STO飼養(yǎng)層組的傳代數(shù)僅為5代，而MEF(小鼠胎兒成纖維細(xì)胞)和BEF(水牛胎兒成纖維細(xì)胞)組為8代以上。在F<,1>代，添加20ng/mLLIF+20ng/mLbFGF+20ng/mLSCF或20ng

6、/mL LIF+40ng/mL bFGF+40ng/mL SCF組的克隆形成數(shù)顯著高于添加10ng/mⅢF+10ng/mL bFGF組和對(duì)照組；在F<,2>-F<,8>代，添加20ng/mLLIF組的克隆形成數(shù)顯著高于添加10ng/mLLIF組。對(duì)照組的傳代數(shù)僅為2代，添加10ng/mL LIF組為5代，而添加20ng/mLLIF組都為8代以上。以上結(jié)果表明，(1)胎牛的性別和胎齡以及分離方法對(duì)水牛EG樣細(xì)胞的分離培養(yǎng)效果有顯著影響，雄

7、性胎牛優(yōu)于雌性胎兒，小于80dpc的胎兒由于大于80dpc的胎兒，機(jī)械分離方法優(yōu)于酶消化法；(2)BEF飼養(yǎng)層利于水牛EG樣細(xì)胞的傳代培養(yǎng)；LIF對(duì)水牛EG樣細(xì)胞的傳代培養(yǎng)有重要作用，而bFGF和SCF的作用不明顯。 3.對(duì)基因轉(zhuǎn)染水牛胚胎生殖樣細(xì)胞(EG-like cells)的影晌因素及利用轉(zhuǎn)GFP基因EG樣細(xì)胞制備嵌合體囊胚的可行性探討。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)體濃度為8μL/mL和12μL/mL的轉(zhuǎn)染率顯著高于2μL/mL和4μL

8、/mL(33.6％，36.2％vs 13.3％，16.8％；P<0.05)；質(zhì)粒DNA2μg/mL組的轉(zhuǎn)染率顯著高于質(zhì)粒DNA 1μg/mL和4μg/mL組(28.8％vs 14.5％，15.2％；P<0.05)；不同代數(shù)水牛EG樣細(xì)胞(0、2、4、8)所獲得的表達(dá)GFP基因克隆率之間差異不顯著(19.8％vs 22.9％VS 25.8％VS 19.0％vs 16.9％；P>0.05)；將轉(zhuǎn)染GFP基因的陽性水牛EG樣細(xì)胞注入到8-16

9、細(xì)胞水牛胚胎后的囊胚發(fā)育率與注入轉(zhuǎn)染GFP基因陽性水牛胎兒成纖維細(xì)胞(BEF)的囊胚發(fā)育率差異不顯著(35.6％vs 33.3％；P>0.05)，但EG樣細(xì)胞組獲得10個(gè)表達(dá)GFP的囊胚，而BEF組則沒有獲得表達(dá)GFP的囊胚。以上結(jié)果表明， 0-8代的水牛EG樣細(xì)胞均可用于GFP基因轉(zhuǎn)染研究，適宜的脂質(zhì)體量和質(zhì)粒DNA濃度分別為8μL/mL和2μg/mL；水牛EG樣細(xì)胞具有胚胎嵌合能力，而成纖維細(xì)胞則無此能力。 4.對(duì)不同代數(shù)水

10、牛EG樣細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染GFP.基因的EG樣細(xì)胞的核移植效果進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同代數(shù)水牛EG樣細(xì)胞(0、2、4、8)以及胎兒成纖維細(xì)胞核移植后的融合卵率、分裂率和囊胚率差異都不顯著82.0％vs 84.5％vs 80.1％vs 78.7％vs 84.0％，67.6％vs 72.9％vs 72.0％vs 62.9％vs 63.1％，11.4％vs 12.4％vs 13.4％vs 10.0％vs 7,1％；P>0.05)；GFP陽性水牛E