雞胚胎生殖細(xì)胞多向分化調(diào)控的研究.pdf

1、與哺乳動(dòng)物相比，雞胚具有易于獲取和操作、結(jié)合病毒轉(zhuǎn)染和電轉(zhuǎn)移可進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作等優(yōu)勢，因而常被作為發(fā)育生物學(xué)和屺較醫(yī)學(xué)研究的模型動(dòng)物。尤其是近年來有關(guān)雞胚各種組織器官發(fā)育分子機(jī)理的研究進(jìn)展較快，這為雞胚更好的作為模型動(dòng)物奠定了一定的基礎(chǔ)。為了更深層次揭示細(xì)胞發(fā)育和分化的機(jī)理，在內(nèi)源性調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)上力圖通過外源性調(diào)控，在體外獲得干細(xì)胞來源、可用于組織功能修復(fù)的組織和器官，本實(shí)驗(yàn)以艾維因雞胚為材料，分離了胚胎期原始生殖細(xì)胞（primordial

2、 germ cell，PGC）并通過傳代培養(yǎng)獲得了大量胚胎生殖(embryonic germ cell，EG)細(xì)胞，建立了EG細(xì)胞體內(nèi)形成畸胎瘤及體外形成類胚體(embryoid body，EB)的模型，探討了多種因素對EG細(xì)胞體外多向分化的調(diào)控，研究了EG細(xì)胞體外向成熟神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞和心肌細(xì)胞分化的潛能。
　　 1.雞胚胎生殖細(xì)胞分離和培養(yǎng)模型的建立
　　 在體視顯微鏡下用玻璃細(xì)針分離3.5～4日胚齡雞胚生

3、殖嵴部位，用胰蛋白酶-EDTA消化分散組織，然后將分散的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)以建立PGC的原代培養(yǎng)模型。所用的高糖DMEM培養(yǎng)液中添加5％胎牛血清(FCS)、10ng/ml白血病抑制因子(LIF)、10ng/ml堿性成纖維生長因子(bFGF)、10ng/ml干細(xì)胞生長因子(SCF)、0.lmmol/L MEM非必需氨基酸、0.1mmol/Lβ-巰基乙醇、2mmol/LL-谷氨酰胺(Gln)、100IU/mi青霉素和100μg/ml鏈霉素（完全培

4、養(yǎng)液）。與體細(xì)胞共培養(yǎng)5d后，利用RT-PCR方法檢測PGC特異性基因Cvh、Dazl和DEH在原代培養(yǎng)形成的PGC集落中的表達(dá)。將表達(dá)PGC特異基因的集落進(jìn)行傳代培養(yǎng)，然后用過碘酸雪夫氏反應(yīng)(PAS)、SSEA-1和SSEA-3及SSEA-4免疫組化、和干細(xì)胞多能性相關(guān)基因PouV.Nanog和Sox2 RT-PCR檢測均證實(shí)傳代后形成的集落為EG陽性克隆。上述結(jié)果表明，PGC-體細(xì)胞原代及傳代共培養(yǎng)并添加多種因子的條件下，PGC在體

5、外可轉(zhuǎn)變?yōu)镋G細(xì)胞，這為研究生殖干細(xì)胞的分化機(jī)制提供了細(xì)胞來源。
　　 2.雞胚胎生殖細(xì)胞體內(nèi)形成畸胎瘤
　　 通過灌飼具有免疫抑制作用的藥物環(huán)孢素A(CsA，5 mg/kg)制作免疫抑制雛雞，將含有1.0×10?個(gè)雞EG細(xì)胞的PBS注射到受劍免疫抑制的雛雞皮下，觀察其分化情況。5周后取皮下形成的組織瘤進(jìn)行切片和HE染色及免疫組化染色鑒定。結(jié)果表明，EG細(xì)胞在免疫缺陷的雛雞皮下可自發(fā)分化為含有神經(jīng)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞

6、、血管、骨細(xì)胞、平滑肌、橫紋肌和腺上皮細(xì)胞等三個(gè)胚層來源的多種細(xì)胞類型的畸胎瘤。而注射同樣數(shù)量EG細(xì)胞到未飼喂環(huán)孢素A組（模型對照組）和注射不含有EG細(xì)胞的免疫抑制雛雞組（細(xì)胞對照組）均未觀察到組織瘤的形成。上述結(jié)果表明通過飼喂免疫抑制作用的藥物環(huán)孢素A可制作免疫抑制雛雞模型，本實(shí)驗(yàn)利用此模型證明了雞EG細(xì)胞在體內(nèi)具有多向分化為含有三個(gè)胚層來源細(xì)胞畸胎瘤的潛能，這為開展生殖干細(xì)胞體內(nèi)分化潛能的研究提供了實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。
　　 3.雞胚

7、胎生殖細(xì)胞體外形成EB模型的建立與優(yōu)化
　　 將EG克隆與體細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化，并利用差速貼壁方法富集EG細(xì)胞。然后無飼養(yǎng)層、無LIF和β-巰基乙醇條件下將雞EG細(xì)胞接種到涂有1％瓊脂的培養(yǎng)板中懸浮培養(yǎng)形成EB。形崴的EB進(jìn)行丫啶橙(AO)染色后在熒光共聚焦顯微鏡下觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu)。對形成7d和14d的類胚體分別進(jìn)行切片和HE組織學(xué)染色，薨通過RT-PCR檢測內(nèi)胚層標(biāo)志基因AFP、外胚層標(biāo)志基因Sox3、中胚層標(biāo)志基因GATA6和滋

8、養(yǎng)層標(biāo)志基因Cdx2在其中的表達(dá)。結(jié)果表明：將富集的雞EG單細(xì)胞采用不含LIF的培養(yǎng)液進(jìn)行懸浮培養(yǎng)4～7d可形成簡單EB，繼續(xù)懸浮培養(yǎng)則其內(nèi)部形態(tài)也發(fā)生改變，最終形成囊狀EB。不同時(shí)間點(diǎn)的EB切片顯示隨著時(shí)間的變化，EB中出現(xiàn)含有神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和胰腺細(xì)胞等三個(gè)胚層的細(xì)胞類型。此外，在體外懸浮培養(yǎng)時(shí)比較了FCS和Gln對EB形成的影響。統(tǒng)計(jì)顯示，隨著懸浮培養(yǎng)時(shí)間的延長，EB的面積不斷增大，F(xiàn)CY濃度和Gin添加量對EB的形成旁生影響顯

9、著，其中以含15％FCS、2 mmoi/L Gln的培養(yǎng)液中EB的形成數(shù)量和狀態(tài)較好。同時(shí)，在EG細(xì)胞體外分化形成EB的第0d、3d、5d和10d分別檢測多能性相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子如PouV,Nanog和Sox2 mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示：在EB體外分化過程中，調(diào)控干細(xì)胞多能性和自我更新的三個(gè)重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)子PouV、Nanog和Sox2表達(dá)量均呈明顯下調(diào)趨勢，提示PouV、Nanog和Sox2在維持雞EG細(xì)胞多潛能性中起著重要作用。上

10、述結(jié)果表明，雞胚EG細(xì)胞通過懸浮培養(yǎng)方法可制備具有向三個(gè)胚層分化能力的EB，此結(jié)果為研究EG細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分佬為特定的細(xì)胞類型奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 4.雞胚EG細(xì)胞體外多向分化調(diào)控的研究
　　 在貼壁培養(yǎng)條件下，利用含10? mol/L RA的ITS誘導(dǎo)液可將EG細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為表達(dá)成熟神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞特異蛋白及基因的神經(jīng)細(xì)胞。部分神經(jīng)元經(jīng)免疫組化及RT-PCR方法鑒定，表明其具有合成多巴胺和膽堿能

11、神經(jīng)遞質(zhì)的功能。利用10μg/ml胰島素、1μmol/L地塞米松和0.2mmol/L吲哚美辛聯(lián)合處理，可誘導(dǎo)EG細(xì)胞定向分化為含有大量脂滴并表達(dá)脂肪細(xì)胞特異性基因PPARγ'、GLUTI和LPL的成熟脂肪細(xì)胞。利用與肝細(xì)胞條件培養(yǎng)聯(lián)合培養(yǎng)的方式可定向誘導(dǎo)EG細(xì)胞分化為肝細(xì)胞，利用PAS染色、免疫細(xì)胞化學(xué)、RT-PCR方法鑒定EG誘導(dǎo)來源的肝細(xì)胞，提示EG細(xì)胞具有分化為含有糖原并分泌白蛋白功能的成熟的肝細(xì)胞。利用添加去甲基化試劑5-aza

12、的培養(yǎng)液懸浮培養(yǎng)，可將EG細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞，表明5-aza具有顯著提高形成規(guī)律性收縮EB比例的作用，其中以添加5μmol/L5-aza組形成的比例最高。形成的EB經(jīng)貼壁分化培養(yǎng)后，采用透射電鏡觀察、熒光免疫組化及RT-PCR方法鑒定EG細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞，結(jié)果顯示5-aza可誘導(dǎo)EG細(xì)胞分化為含有肌小結(jié)和縫隙連接、表達(dá)心肌細(xì)胞特異性蛋白和標(biāo)志基因的心肌細(xì)胞。
　　 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：從雞胚生殖嵴分離的PGC與體細(xì)胞原代共培

13、養(yǎng)并經(jīng)傳代所建立的培養(yǎng)模型可用于EG細(xì)胞制備和分化調(diào)控的研究，經(jīng)PAS組化、SYEA-1和SSEA-3及SSEA-4免疫細(xì)胞化學(xué)染色、干細(xì)胞多能性相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PouV、Nanog和Sox2的RT-PCR法檢測、在免疫抑制雛雞體內(nèi)形成含有三個(gè)胚層來源細(xì)胞的畸胎瘤等多種方法均證實(shí)了EG細(xì)胞的干細(xì)胞特性。將富集的雞EG細(xì)胞懸浮培養(yǎng)形成簡單EB和囊狀EB，培養(yǎng)液中添加15％FCS和2mmol/L Gln可促進(jìn)EB的形成。在EB體外分化過

14、程中，PouV,Nanog和Sox2表達(dá)量均呈明顯下調(diào)趨勢，而三個(gè)胚層的標(biāo)志基因AFP、Sox3和GA TA6及滋養(yǎng)層標(biāo)志基因Cdx2出現(xiàn)表達(dá)，表明EG細(xì)胞通過懸浮培養(yǎng)方法可制備具有向三個(gè)胚層分化能力的EB。貼壁培養(yǎng)的EB經(jīng)不同的誘導(dǎo)劑處理后，經(jīng)細(xì)胞特異性的標(biāo)志基因或蛋白的表達(dá)鑒定，EB可定向分化成有功能的神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞及心肌細(xì)胞。以上結(jié)果提示利用所建立的EG/EB體外制備和定向誘導(dǎo)分化模型可用于生殖干細(xì)胞發(fā)育調(diào)控機(jī)制的研究