人胚胎干細(xì)胞傳代培養(yǎng)方法與其遺傳穩(wěn)定性的相關(guān)研究.pdf

1、人胚胎干細(xì)胞（HumanEmbryonicStemCells，hESCs）來(lái)源于胚胎發(fā)育過(guò)程中囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(InnerCellMass，ICM)。hESCs傳代過(guò)程中具有自身的特性，即，保持自我更新、增殖、自主分化以及多能性的特性。近些年，對(duì)于人胚胎干細(xì)胞的研究越來(lái)越受到科研學(xué)者的關(guān)注。
　　人胚胎干細(xì)胞研究的最終目的是應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)治療，但其安全性需要提前明確。探索hESCs的遺傳穩(wěn)定性對(duì)其安全性研究至關(guān)重要。胚胎干細(xì)胞的遺傳

2、穩(wěn)定性受到很多因素影響，例如，傳代方法，傳代時(shí)間等。隨著hESCs長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)，hESCs的遺傳穩(wěn)定性會(huì)出現(xiàn)發(fā)生改變。不同的傳代方法，包括機(jī)械法以及酶法傳代也會(huì)使其改變。傳統(tǒng)的G顯帶鑒定法最早應(yīng)用于檢測(cè)hESCs的遺傳改變，近來(lái)，單核苷酸多態(tài)性（SNP，Singlenucleotidepolymorphism）芯片由于其更加精準(zhǔn)的檢測(cè)被逐漸應(yīng)用于hESCs。中華8芯片特別覆蓋中國(guó)人特有的常見(jiàn)和稀有變異，能夠精確地反應(yīng)中國(guó)人的遺傳變異特點(diǎn)

3、。應(yīng)用該芯片技術(shù)于中國(guó)人胚胎建立而成的干細(xì)胞系，可更有利于鑒定中國(guó)人干細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性變異。
　　本研究旨在探索適應(yīng)于我中心hESCs的不同傳代方法，并且應(yīng)用SNP芯片分析hESCs長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中基因遺傳的變化，最終為確認(rèn)hESCs傳代過(guò)程的遺傳安全性提供理論依據(jù)及實(shí)踐基礎(chǔ)。本研究的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn):.應(yīng)用適合中國(guó)人遺傳變異的Omni中華8芯片，檢測(cè)利用中國(guó)人胚胎建立的人胚胎干細(xì)胞系的遺傳學(xué)變異。
　　目的
　　探索適應(yīng)于我

4、中心人胚胎干細(xì)胞類型的不同傳代方法，以及長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)對(duì)其遺傳穩(wěn)定性的影響。
　　方法
　　1.利用鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心來(lái)源新鮮廢棄胚胎所建立的hESC系，均已經(jīng)過(guò)全能性鑒定。采用傳統(tǒng)的機(jī)械傳代法，以及利用胰酶、Ⅳ型膠原酶法進(jìn)行hESCs傳代培養(yǎng)，傳代后的hESCs種植于小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和人包皮成纖維細(xì)胞按1∶1混合的飼養(yǎng)層上。
　　2.分別提取Zh2系P35/P60代的基因組DNA，應(yīng)用高分辨率Omni中

5、華8芯片檢測(cè)人胚胎干細(xì)胞基因組DNA，分析其分子遺傳學(xué)變異。
　　結(jié)果
　　1.Ⅳ型膠原酶?jìng)鞔ê馁M(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，不宜掌控消化時(shí)間和接種密度;0.25％EDTA-胰蛋白酶消化hESCs成單細(xì)胞狀態(tài)，接種于飼養(yǎng)層后不利于繼續(xù)生長(zhǎng);機(jī)械法傳代可以根據(jù)需要切割成大小不同的團(tuán)塊，并可以切除分化的或者狀態(tài)偏差的細(xì)胞，更加適合hESCs傳代。
　　2.利用中華8芯片對(duì)比我中心hESCs的Zh2-P35和Zh2-P60，可檢測(cè)出1130