PGF2α-FP受體與糖尿病心肌病心肌間質(zhì)纖維化的研究.pdf

1、論文Ⅰ:PFG2α通過FP受體/PKC/Rho激酶信號通路促進心肌成纖維細胞分泌膠原獨立于TGF-β1
　　背景：
　　糖尿病心肌病(DiabeticCardiomyopathy,DCM)是導(dǎo)致糖尿病病人罹難率升高的重要原因，迄今為止依然是人類心臟疾病中危險性最大的疾病之一。其作為一種獨立并且特異性的心肌病變受到越來越多的關(guān)注。DCM的病理變化復(fù)雜多端，涉及到許多領(lǐng)域，其中主要涉及到心肌細胞和心肌間質(zhì)兩個領(lǐng)域。對于DCM的研

2、究是一個逐漸演變的過程，在過去幾十年的的研究中，研究領(lǐng)域重點主要放在心肌細胞的變化上，比如心肌細胞的肥大、凋亡和壞死;最近幾年來，越來越多的學(xué)者把研究的重點轉(zhuǎn)移到以前涉足較少的領(lǐng)域上來-心肌間質(zhì)上來。許多研究發(fā)現(xiàn)，心肌間質(zhì)領(lǐng)域——心肌間質(zhì)纖維化在DCM的發(fā)生和發(fā)展中起著舉足輕重的作用。研究心肌間質(zhì)纖維化的病理生理過程以及影響機制或許成為攻克糖尿病心肌病的一個新的研究靶點。
　　心肌間質(zhì)纖維化指的是心肌組織成纖維細胞（cardiac

3、fibroblasts）過度增生從而導(dǎo)致細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)大量沉積而形成的病理演變。心臟正常的成年人處在健康平衡生理狀態(tài)下，心肌成纖維細胞細胞分泌和產(chǎn)生的膠原，是一個動態(tài)平衡過程。ECM主要成分包括膠原Ⅰ和膠原Ⅲ。生理學(xué)角度上來說，ECM的作用是作為“腳手架蛋白”從而把心肌、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞和血管聯(lián)系起來的橋梁，促使形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)進而使心肌產(chǎn)生抗張強度，這也就使得心肌產(chǎn)生了收縮和舒張功能。當(dāng)處

4、于病理狀態(tài)下，比如氧化應(yīng)激，高糖狀態(tài)下，由于成纖維細胞受到外界的不適刺激，產(chǎn)生和分泌的膠原打破了動態(tài)平衡，導(dǎo)致ECM的過量累積。ECM的過量沉積會導(dǎo)致心臟壁松弛性的降低和僵硬度的升高，這將首先影響到心肌的舒張功能，進一步將會出現(xiàn)類似于限制性心肌病的改變。在病理情況下，過度累計的ECM在臨床上的主要表現(xiàn)為:早期發(fā)生舒張功能的障礙，晚期發(fā)生收縮功能的障礙。
　　詳細說來，在心臟中，包括心肌細胞和非心肌細胞。非心肌細胞主要是心肌成纖維細

5、胞，約占細胞總數(shù)的60％-70％。心肌成纖維細胞產(chǎn)生和分泌的Ⅰ型、Ⅲ型膠原是最重要的細胞外基質(zhì)?，F(xiàn)已證實，給予心肌成纖維細胞高糖刺激可以引起膠原Ⅰ/Ⅲ分泌增加。但是，在體外模擬糖尿病狀態(tài)下，引起心肌成纖維細胞膠原沉積的分子機制仍所知甚少。所以研究心肌成纖維細胞分泌膠原的分子機制是迫在眉睫的問題。
　　胰島素抵抗(insulinresistance，IR)在DCM的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，許多研究發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗所引起的高糖血癥和

6、高胰島素血癥與纖維化密切相關(guān)。胰島素和其受體胰島素受體結(jié)合后的信號傳導(dǎo)通路包括兩條:其中一條是胰島素底物受體(InsulinReceptorSubtract-IRS/phosphatidylinositol3-kinase-PI3K/proteinkinaseB(Akt/PKB)信號通路，主要是影響糖脂代謝和蛋白質(zhì)合成，這一信號通路稱為代謝信號通路;另外一條信號通路是(mitogen-activatedproteinkinase-MAP

7、K(促分裂原活化蛋白激酶)信號通路途徑，主要參與對基因的轉(zhuǎn)錄過程和細胞的增殖過程的調(diào)控，稱為生長信號通路。在胰島素抵抗時，IRS/PI3K/Akt信號通路途徑出現(xiàn)明顯的受損[11]，而MAPK途徑功能仍舊保持其正常[12]，或許出現(xiàn)功能增強，這就是我們所謂的“選擇性”胰島素抵抗。MAPK活性的增強可以促進很多生長因子發(fā)揮作用。最為經(jīng)典的是刺激轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)的表達[13]。TGF-β信號分子是典型的致纖維化因子[14]。但是國

8、內(nèi)學(xué)者對于TGF-β的大量研究發(fā)現(xiàn)，對于其的干預(yù)，甚至基因敲除，只能減輕不能完全遏制心肌纖維化的進程[15,16]。這提示著在致心肌纖維化中還存在其他信號通路。Oga等證實，在肺間質(zhì)纖維化形成過程中，PGF2α-FP通路是除了TGF-β外另一重要的致纖維化的途徑，它獨立于TGF-β經(jīng)典通路而直接作用于肺成纖維細胞促進其增殖和膠原的合成，導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化[17，18]。而PGF2α-FP通路對于心肌成纖維細胞的研究尚未有人涉足。在DCM胰

9、島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，PGF2α/FP受體信號通路是否參與了心肌成纖維細胞膠原的合成研究甚少。
　　PGF2α是花生四烯酸在環(huán)氧化酶作用下的代謝產(chǎn)物。近幾年來發(fā)現(xiàn)，在胰島素抵抗病人的尿液中，或肥胖病人的體內(nèi)，PGF2α的水平是明顯增加的。所以在對于糖尿病胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下一些病理因子和炎癥因子的研究中，PGF2α的地位受到越來越多人的關(guān)注，日趨重要起來。最近，在對PGF2α的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PGF2α存在時，可以與其特異受體FP受體結(jié)合，兩

10、者結(jié)合后可以引起一系列生理活性反應(yīng)。不僅激活PKC、Rho激酶信號通路，同時還抑制PI3K的活性。PGF2α與PI3K競爭性結(jié)合FP受體。PI3K位于細胞內(nèi)，所以當(dāng)PI3K活性受到抑制時，與其結(jié)合的包內(nèi)FP受體量就會減少，使FP受體內(nèi)化(internalization)減少，細胞膜表面上的FP受體量明顯增多，從而可以結(jié)合更多的PGF2α[19-23]，形成正反饋循環(huán)。在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，上述正反饋是否依然存在？PGF2α-FP受體/PK

11、C/Rho激酶信號通路能否誘導(dǎo)大鼠成纖維細胞分泌膠原的增加，目前尚未有人研究。簽于此，本實驗設(shè)定這樣的假說前提:在正常糖和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，PGF2α-FP受體/PKC/Rho激酶信號通路促進心肌成纖維細胞膠原的合成。
　　為了驗證這一假說，我們進行了下列實驗:1.在正常糖和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，PGF2α刺激對大鼠成纖維細胞的膠原Ⅰ、膠原Ⅲ、PGF2α-FP受體相應(yīng)的mRNA和蛋白質(zhì)表達的影響;2.在正常糖和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，PGF

12、2α對PI3K/Akt、FP受體/PKC/Rho激酶信號通路的檢測;3.在正常糖和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，應(yīng)用分子阻斷劑技術(shù)，檢測PGF2α/FP受體/PKC/Rho激酶信號通路對心肌成纖維細胞合成膠原功能的影響中的作用;4.PGF2α-FP受體信號通路獨立于TGF-β1信號通路的檢測。本研究的主要目的在于，在正常糖條件和胰島素抵抗條件下，PGF2α對心肌成纖維細胞膠原合成功能的影響及可能的信號介導(dǎo)機制。
　　研究目的：
　　1.

13、在正常糖和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，PGF2α對心肌成纖維細胞FP受體、Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA和蛋白質(zhì)表達的影響;
　　2.在正常糖和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，PGF2α對PI3K/Akt、FP受體/PKC/Rho激酶信號通路的檢測;
　　3.在正常糖和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，應(yīng)用分子阻斷劑技術(shù)，檢測PGF2α/FP受體/PKC/Rho激酶信號通路對心肌成纖維細胞合成膠原功能的影響中的作用;
　　4.PGF2α-FP受體信號通路獨立于TGF

14、-β1信號通路的檢測
　　研究方法
　　本研究以原代培養(yǎng)的新生乳鼠心肌成纖維細胞為對象。采用實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(realtimeRT-PCR)，蛋白免疫印跡(westernblotting)、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)等實驗方法，分別觀察:
　　1.在體外模擬胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，分為正常糖組(5.5mmol/L)、正常糖+PGF2α(5.5mmol/L+PGF2α)、胰島素抵抗模型組+PGF2α（15mmol/L+

15、104μU/ml+PGF2α），檢測FP受體mRNA以及Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA和蛋白含量;
　　2.在正常糖組、胰島素抵抗模型組，加入PGF2α刺激0min，30min、60min、120min，觀察PI3K/Akt、FP受體/PKC/Rho激酶信號通路的變化;
　　3.在正常糖組、胰島素抵抗模型組，加入FP受體，PKC，Rho激酶抑制劑后，觀察對PGF2α刺激Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA和蛋白表達的影響;
　　4.在正常糖

16、組、胰島素抵抗模型組，加入FP受體，TGF-β1抑制劑后，觀察對PGF2α或者TGF-β1刺激Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA和蛋白表達的影響。
　　結(jié)果：
　　1.在正常糖和胰島素抵抗模型狀態(tài)下加入PGF2α刺激1h:PGF2α刺激下，與正常糖對照組相比，模型+PGF2α組和正常糖+PGF2α組心肌成纖維細胞FP受體mRNA的表達均顯著增高(15.06±0.02vs.1.00±0.00;1.86±0.50vs.1.00±0.00，P

17、＜0.05)，且模型+PGF2α組高于正常糖+PGF2α組;模型+PGF2α組和正常糖+PGF2α組心肌成纖維細胞FP受體蛋白的表達也顯著增高（1.13±0.16vs.0.29±0.03;0.69±0.08vs.0.29±0.03，P＜0.05）;刺激4h:與正常糖對照組相比，模型+PGF2α組和正常糖+PGF2α組心肌成纖維細胞FP受體mRNA的表達均顯著增高（9.36±0.74vs.1.00±0.00;1.28±0.05vs.1.0

18、0±0.00，P＜0.05），且模型+PGF2α組高于正常糖+PGF2α組;模型+PGF2α組和正常糖+PGF2α組心肌成纖維細胞FP受體蛋白的表達也顯著增高(0.56±0.03vs.0.39±0.01;0.47±0.02vs.0.39±0.01，P＜0.05)。模型+PGF2α組和正常糖+PGF2α組心肌成纖維細胞膠原Ⅰ/Ⅲ的表達也顯著增高(膠原Ⅰ:18.97±0.87vs.1.00±0.00，3.48±0.70vs.1.00±0.0

19、0;膠原Ⅲ:3.72±0.21vs.1.00±0.00，1.62±0.14vs.1.00±0.00);刺激24h:（膠原Ⅰ:29.46±3.00vs.6.81±0.47,17.95±0.79vs.6.81±0.47;膠原Ⅲ:5.10±0.10vs.1.23±0.027,3.20±0.033vs.1.23±0.027）。
　　2.在正常糖條件下和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，PGF2α不僅使心肌成纖維細胞PI3K、AKT磷酸化水平均顯著下降;還

20、使FP受體、PKC、Rho激酶活化程度均顯著增加。
　　3.正常糖條件下，與PGF2α組相比，F(xiàn)P受體抑制劑AL-8810、PKC抑制劑LY-333531、Rho激酶抑制劑Y-27632可明顯抑制PGF2α引起的膠原Ⅰ、ⅢmRNA和蛋白水平的增加(P＜0.05)，膠原ⅠmRNA下降了47.59％、49.11％、49.00％，膠原ⅢmRNA下降了21.5％、27.25％、21.76％;膠原Ⅰ蛋白下降了14.83％、19.31％、14

21、.11％，膠原Ⅲ蛋白下降了9.5％、13.45％、17.89％。胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，與PGF2α組相比，AL-8810、LY-333531、Y-27632可明顯抑制PGF2α引起的膠原Ⅰ、ⅢmRNA和蛋白水平的增加(P＜0.01～0.001)，膠原ⅠmRNA下降了80.48％、82.03％、83.50％，膠原ⅢmRNA下降了26.49％、29.60％、36.08％，膠原Ⅰ蛋白下降了41.62％、35.07％、41.71％，膠原Ⅲ蛋白下降了

22、22.33％、18.13％、18.20％。
　　4.在正常糖條件下和胰島素抵抗模型條件下，AL-8810、AL-8810+SB-505124可明顯抑制PGF2α引起的膠原Ⅰ、ⅢmRNA水平的增加（P＜0.05），但是SB-505124對PGF2α引起的膠原Ⅰ、ⅢmRNA水平的增加無明顯抑制作用(P＞0.05);增加SB-505124的濃度至10μmol/，仍然對PGF2α引起的膠原Ⅰ、ⅢmRNA水平的增加無明顯抑制作用;同樣SB-

23、505124、AL-8810+SB-505124可明顯抑制TGF-β1引起的膠原Ⅰ、ⅢmRNA水平的增加(P＜0.05)，但是AL-8810對TGF-β1引起的膠原Ⅰ、ⅢmRNA水平的增加無明顯抑制作用（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下PGF2α可顯著增高心肌成纖維細胞FP受體和膠原Ⅰ、Ⅲ的表達水平
　　2.在正常糖條件下和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，PGF2α不僅使FP受體/PKC/Rho激酶信號傳導(dǎo)通路

24、激活還鈍化PI3K/Akt信號通路。
　　3.在正常糖條件和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，PGF2α可通過FP受體/PKC/Rho激酶信號通路刺激大鼠心肌成纖維細胞膠原Ⅰ、ⅢmRNA和蛋白質(zhì)的表達。
　　4.正常糖和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，PGF2α刺激膠原表達Ⅰ、Ⅲ的增加均是通過FP受體信號通路實現(xiàn)的，其作用獨立于TGF-β1信號通路。
　　論文Ⅱ:FP受體基因沉默對糖尿病心肌病心肌間質(zhì)纖維化的保護作用
　　背景：
　　糖

25、尿病心肌病是由糖尿病引起的心肌的結(jié)構(gòu)和功能的改變的代謝紊亂性疾病?，F(xiàn)有的流行病學(xué)和臨床資料標(biāo)明，糖尿病心肌病亦是升高糖尿病患者罹難率和罹患率的首要病因，因此作為一種獨立的，特異的心肌病變，受到越來越多人的關(guān)注[1,2]。最近十幾年來，心血管領(lǐng)域眾多學(xué)者對它的發(fā)病的復(fù)雜機制進行大量的臨床實驗研究和基礎(chǔ)研究，對于其最終的發(fā)病機制的探討仍然不成熟。故而，對于更進一步探討糖尿病心肌病的最終發(fā)病的機制，研究遏制糖尿病心肌病的發(fā)病的途徑對其防治有歷

26、史性意義。
　　糖尿病心肌病的發(fā)生與眾多因素復(fù)雜相關(guān)，是一個極其復(fù)雜的病理過程。其中，代謝紊亂（高糖血癥和高胰島素血癥），心肌細胞的自噬和凋亡，心肌間質(zhì)纖維化，微血管的病變等都是糖尿病心肌病的病理過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[2]。病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病心肌組織形態(tài)學(xué)上主要表現(xiàn)為細胞外基質(zhì)(ECM)沉積和心肌纖維化[3]。所以，心肌纖維化在糖尿病心肌病中的作用日益受到重視，但是其具體機制仍未完全闡明。
　　心肌間質(zhì)纖維化的機

27、制錯綜復(fù)雜，胰島素抵抗，炎癥，激素的作用都會引起心肌間質(zhì)纖維化。目前為止，許多學(xué)者逐一研究了上述各個原因與纖維化的關(guān)系[4,5]。但是，胰島素抵抗與激素相互作用與心肌纖維化的研究，尚未有人涉足。因此，深入研究胰島素抵抗與各種相關(guān)激素之間的相互作用與心肌纖維化之間的深層鏈接的關(guān)系具有深遠的意義。
　　胰島素抵抗在纖維化的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[5]。在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，PI3K/Akt這一代謝信號通路受損[6,7]。PI3K/Ak

28、t信號通路的弱化會導(dǎo)致PGF2α與FP受體的過度結(jié)合，因為PGF2α與PI3K競爭性結(jié)合FP受體[8]。近幾年來，PGF2α作為一個新的致纖維化的激素受到越來越多的關(guān)注。Oga已經(jīng)證實，PGF2α與FP受體結(jié)合可以促進肺間質(zhì)膠原沉積，從而導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化[9,10]。另一方面，PGF2α與FP受體結(jié)合后可以活化PKC[11]或者Rho激酶[10];而PKC和Rho激酶是經(jīng)典的致纖維化因子，兩者之間不僅能相互作用[12]，而且能引起纖維化

29、[13,14]。但是，在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，PGF2α-FP受體/PKC/Rho激酶信號通路能否引起心肌間質(zhì)纖維化，目前未見相關(guān)研究。
　　因此，我們提出這樣的假設(shè)，在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，PGF2α/FP受體PKC/Rho激酶信號通路可能參與了糖尿病心肌病心肌間質(zhì)纖維化的過程。所以，我們建立了二型糖尿病動物模型，運用FP受體基因沉默技術(shù)來研究PGF2α-FP受體對糖尿病心肌病心肌間質(zhì)纖維化影響及可能的信號傳導(dǎo)機制。
　　目的：<

30、br>　　1.建立二型糖尿病動物模型和糖尿病基因沉默動物模型
　　2.探討在糖尿病狀態(tài)下和基因沉默狀態(tài)下，PGF2α-FP受體對糖尿病心肌病心肌間質(zhì)纖維化影響及可能的信號傳導(dǎo)機制
　　方法：
　　雄性SD大鼠40只，隨機分為兩組:正常對照組（n=8只），糖尿病組(n=32只)，正常對照組大鼠以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng);糖尿病組大鼠以高脂高糖高熱量飼料喂養(yǎng)。四周后，糖尿病組大鼠禁食12h后，腹腔內(nèi)注射鏈脲菌素(STZ)27.5mg/

31、kg，正常對照組大鼠注射等量檸檬酸鈉/檸檬酸緩沖液。注射STZ一周后，連續(xù)三次通過尾靜脈取血檢測動物血糖，若空腹血糖＞7.1或者隨機血糖＞11.1者納入糖尿病模型組。此時，糖尿病組大鼠分為四個亞組:糖尿病組(n=7)，糖尿病+空載體注射組(n=7)，糖尿病+腺病毒（FP受體sh-RNA）注射組(n=7)，糖尿病+腺病毒（FP受體sh-RNA）注射+PGF2α注射組(n=7)。動物血糖升高后，繼續(xù)喂養(yǎng)14周。在第19周末，采用頸靜脈注射法

32、給予腺病毒組大鼠注射腺病毒2.5*1010PFU，給予空載體組大鼠注射同等量的空載體。兩周后，即第21周末，重復(fù)注射同等劑量的腺病毒;同時，最后一組，即糖尿病+腺病毒（FP受體sh-RNA）注射+PGF2α注射組，給予PGF2α(0.1mg/kg)連續(xù)肌肉注射2周。第23周，處死動物，留取動物標(biāo)本。實驗過程中，進行以下檢測:①實驗?zāi)┐笫篌w重測量和心臟重量測量，血壓，飲水，飲食，以及尿量檢測。②分別于實驗開始基線水平，注射STZ前（四周高

33、脂飲食喂養(yǎng)后）、注射STZ后1周、糖尿病中期（第17周）、注射腺病毒前和實驗?zāi)╊i靜脈取血測定空腹血糖、空腹胰島素、甘油三酯、膽固醇，PGF2α，并計算胰島素敏感指數(shù)(1SI)。③分別于實驗開始基線水平、四周高脂喂養(yǎng)后，實驗?zāi)┻M行胰島素耐量和糖耐量檢測。④于實驗?zāi)┮孕膶?dǎo)管法進行左室舒張末壓(LVEDP)檢測。⑤應(yīng)用H&E，Masson，天狼猩紅染色進行心肌組織間質(zhì)膠原定量。⑥實時定量RT-PCR法和WB法檢測FP受體mRNA和蛋白的表達以

34、及PKC和Rho激酶的表達。⑦采用免疫組織化學(xué)法檢測膠原Ⅰ/Ⅲ蛋白的表達。
　　結(jié)果：
　　1.實驗動物基本情況
　　與正常對照組相比，糖尿病大鼠心臟重量，飲水，飲食以及尿量明顯增加。給予FP受體基因沉默治療后，與空載體組相比，單純腺病毒注射組和腺病毒+PGF2α注射組飲水和尿量明顯減少，心臟重量和飲食量稍微減少。
　　2.大鼠生化指標(biāo)檢測
　　高脂高熱量飼料喂養(yǎng)4周后，與正常對照組相比，糖尿病組血清甘油三

35、酯和空腹血糖明顯上升(P＜0.05)，血清膽固醇，PGF2α和空腹胰島素升高，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，胰島素敏感指數(shù)(ISI)明顯下降（P＜0.05）。
　　STZ注射后1周，與正常對照組相比，糖尿病組血清膽固醇，甘油三酯，空腹血糖，PGF2α和空腹胰島素明顯升高（P＜0.01）;胰島素敏感指數(shù)(ISI)明顯下降(P＜0.01)，這種狀態(tài)一直持續(xù)到實驗?zāi)?br>　　實驗?zāi)?，與糖尿病組相比:單純腺病毒注射組和腺病毒+PG

36、F2α注射組，血清膽固醇，甘油三酯，空腹血糖和空腹胰島素明顯下降（P＜0.05），胰島素敏感指數(shù)(ISI)也明顯上升(P＜0.05)，PGF2α水平仍然很高(P＜0.05)。
　　3.大鼠糖耐量和胰島素耐量檢測
　　與基線水平相比，高脂高熱量飼料喂養(yǎng)4周后，糖尿病組大鼠胰島素耐量和糖耐量開始受損，糖耐量和胰島素耐量曲線下面積AUC明顯增加，這種狀態(tài)一直持續(xù)到實驗?zāi)?br>　　實驗?zāi)?，與糖尿病組相比，單純腺病毒注射組和腺病毒

37、+PGF2α注射組胰島素耐量和糖耐量明顯改善，糖耐量和胰島素耐量曲線下面積AUC明顯降低。
　　4.大鼠心導(dǎo)管檢測
　　與對照組相比，糖尿病組大鼠舒張末期左室內(nèi)壓力(LVEDP)明顯增加;給予腺病毒注射后，單純腺病毒注射組和腺病毒+PGF2α注射組LVEDP明顯下降。
　　5.組織形態(tài)學(xué)觀察
　　正常對照組心肌左室和血管周圍膠原組織分布均勻，糖尿病組心肌內(nèi)和管周膠原含量明顯增多。定量分析結(jié)果顯示:與正常對照組相比

38、，糖尿病組左室心肌組織膠原容積分?jǐn)?shù)和血管周圍纖維化指數(shù)明顯升高（P＜0.05）。給予腺病毒治療后，單純腺病毒注射組和腺病毒+PGF2α注射組，心肌膠原含量顯著下降，血管周圍纖維化程度減弱。定量分析結(jié)果顯示:與空載體組相比，單純腺病毒注射組和腺病毒+PGF2α注射組，心肌組織膠原容積分?jǐn)?shù)和血管周圍纖維化指數(shù)明顯下降(P＜0.05)。天狼猩紅染色也觀察到同樣的結(jié)果。
　　6.信號通路檢測
　　與對照組相比，糖尿病大鼠體內(nèi)FP受體

39、mRNA和蛋白質(zhì)的含量明顯增加，磷酸化PKCβ2和MYPT-1水平也明顯增加，磷酸化Akt活性明顯下降;給予FP受體基因沉默治療后，不僅FP受體mRNA和蛋白質(zhì)的含量明顯下降，磷酸化PKCβ2和MYPT-1水平也明顯下降;受損的Akt活性逐漸恢復(fù)。
　　7.免疫組化檢測心肌組織FP受體分布
　　從免疫組織化學(xué)圖片上顯示，我們可以看出，與對照組相比，糖尿病狀態(tài)下，F(xiàn)P受體的分布廣泛而密集，表達量增加;給予FP受體腺病毒注射后，

40、FP受體分布相對稀疏而零散，表達量減少，同樣FP受體腺病毒注射后，即使同時又給予PGF2。注射，F(xiàn)P受體分布與單純FP受體腺病毒干預(yù)組相比沒有明顯變化;統(tǒng)計學(xué)結(jié)果亦得到同樣結(jié)果。
　　8.免疫組化檢測膠原Ⅰ/Ⅲ
　　免疫組化顯示，與正常對照組相比，糖尿病組膠原Ⅰ/Ⅲ的蛋白表達明顯上調(diào);FP受體基因沉默治療后，與空載體組相比，單純腺病毒注射組和腺病毒+PGF2α注射組膠原Ⅰ/Ⅲ表達明顯下降。
　　結(jié)論：
　　1.四

41、周高脂高熱量飲食，糖尿病組大鼠體內(nèi)出現(xiàn)代謝紊亂，這種代謝紊亂一直持續(xù)到實驗?zāi)?四周腺病毒注射后，代謝紊亂得到了緩解。
　　2.糖尿病組大鼠出現(xiàn)糖耐量受損和胰島素抵抗;FP受體基因沉默治療后，這種糖耐量受損和胰島素抵抗得到了一定程度的改善。
　　3.在糖尿病大鼠體內(nèi)出現(xiàn)心臟舒張功能障礙，給予FP受體腺病毒基因沉默治療后，心臟舒張功能障礙得到一定程度的改善。
　　4.在2型糖尿病動物體內(nèi)存在心肌間質(zhì)纖維化現(xiàn)象，給予FP受體