Survivin對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路.pdf

1、子宮內(nèi)膜癌是常見的婦科惡性腫瘤，以腺癌最常見。由于目前尚缺乏對(duì)子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的確切分子機(jī)制的了解，嚴(yán)重阻礙了有效預(yù)防的發(fā)展。 Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，具有調(diào)控細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的雙重作用。近年來的研究表明，它在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。但其與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及其對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響研究甚少。本課題從研究survivin在正常子宮內(nèi)膜、不典型增生子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜癌組織和細(xì)胞株中的

2、表達(dá)入手，利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)抑制了子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中survivin的表達(dá)，并運(yùn)用RT一PCR、westernblot、Brdu實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)、MTT、劃痕實(shí)驗(yàn)、Matrigel體外侵襲實(shí)驗(yàn)等探討它在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、凋亡和運(yùn)動(dòng)、侵襲過程中的作用。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示survivin在子宮內(nèi)膜癌中的異常表達(dá)及其作用可能是影響子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生物學(xué)行為的重要因素之一。 本課題共分四個(gè)部分：①Survi

3、vin在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)；②Survivin對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響；③Survivin對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、侵襲能力的影響；④子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中EGFR／Ras／Raf／MAPK信號(hào)通路對(duì)survivin表達(dá)的調(diào)控。 第一部分Survivin在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá) 目的檢測(cè)survivin在正常子宮內(nèi)膜、不典型增生子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)，探討它與子宮內(nèi)膜癌的關(guān)系。 方法應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄

4、聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、Westernblot和免疫組織(細(xì)胞)化學(xué)方法檢測(cè)survivinmRNA和蛋白在正常子宮內(nèi)膜、不典型增生子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜癌組織和細(xì)胞株Ishikawa、HEC-1一A中的表達(dá)，并比較它們之間的表達(dá)差異。 結(jié)果(1)SurvivinmRNA在正常子宮內(nèi)膜、不典型增生子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜癌組織中均有表達(dá)。SurvivinmRNA在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)水平顯著高于不典型增生子宮內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜組織

5、(均為P(O．05)。SurvivinmRNA在兩株子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa和HEC一卜A中均為強(qiáng)陽性表達(dá)。(2)Survivin蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)水平顯著高于不典型增生子宮內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜組織(分別為P(O．05和P(O．01)。Survivin蛋白在兩株子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa和HEC一卜A中也均為強(qiáng)陽性表達(dá)，與RT—PCR結(jié)果一致。Survivin蛋白在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的表達(dá)部位主要是細(xì)胞漿。 結(jié)論

6、Surviyin的過度表達(dá)可能與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生有關(guān)。 第二部分Survivin對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響 目的探討survivin對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控作用及其相關(guān)機(jī)制。 方法針對(duì)survivinmRNA序列設(shè)計(jì)了三條survivin特異性的siRNAs和一條陰性對(duì)照non—targetsiRNA，并分別克隆入pRNA質(zhì)粒載體。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Ishikawa細(xì)胞，用RNAi抑制Ishikawa細(xì)

7、胞中survivin的表達(dá)。采用盯一PCR和Westernblot檢測(cè)干擾效果，BrdU實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)干擾前后細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的變化。并用Westernblot檢測(cè)了與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的cyclinD1、cyclinE、p-RB的表達(dá)以及與凋亡密切相關(guān)的caspase一3、caspase一8、bcl一2的表達(dá)，初步探討survivin調(diào)控細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的途徑。 結(jié)果(1)成功構(gòu)建了三個(gè)針對(duì)survivin基因mR

8、NA不同位點(diǎn)的重組質(zhì)粒pRNAT—suvl，pRNAT—suv2，pRNAT-suv3和一個(gè)陰性對(duì)照質(zhì)粒pRNAT—neg。其中兩個(gè)質(zhì)粒pRNAT—suv2和pRNAT—suv3特異并有效地抑制了Ishikawa細(xì)胞中survivin的表達(dá)，同未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染pRNAT—neg組相比，surviyinmRNA的表達(dá)水平分別被抑制了(78．97±4．13)％和(80．23±5．42)％(均為P(O．01)；survivin蛋白的表達(dá)水平分別

9、被抑制了(8L61±3．45)％和(82．63±4．76)％(均為P＜0．01)。(2)RNA干擾survivin使細(xì)胞周期阻滯在G1期，顯著抑制了細(xì)胞的增殖。四組細(xì)胞的增殖率分別為：未轉(zhuǎn)染組(52．42±3．17)％，轉(zhuǎn)染pRNAT-neg組(49．67±2．52)％，轉(zhuǎn)染pRNAT-suv2組(33±2．65)％，轉(zhuǎn)染pRNAT—suv3組(34±2．0)％。干擾組與陰性對(duì)照組分別比較，差異均有顯著性(均為P＜0．01)。(3)細(xì)胞

10、周期蛋白cyclinD1和p—RB在RNA干擾后表達(dá)明顯下降，而eyclinE含量則無明顯變化。(4)RNA干擾surviyin誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。四組細(xì)胞的凋亡率分別為：未轉(zhuǎn)染組(2．17±0．05)％，轉(zhuǎn)染pRNAT-neg組(3．99±0．17)％，轉(zhuǎn)染pRNAT—suv2組(38．48±2．13)％，轉(zhuǎn)染pRNAT-suv3組(39．39±2．55)％。干擾組與陰性對(duì)照組分別比較，差異均有顯著性(均為P(O．01)。(5)RNA干擾

11、survivin使caspase-3和caspase-8裂解增加，而bcl一2的表達(dá)無明顯變化。 結(jié)論RNAi抑制survivin的表達(dá)可以抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能是通過下調(diào)cyc¨nD1和p—RB蛋白的表達(dá)水平以及增加caspase一3和caspase一8的裂解引起的。 第三部分Survivin對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、侵襲能力的影響 目的探討survivin對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、侵襲能力

12、的調(diào)節(jié)作用。 方法將第二部分構(gòu)建的重組質(zhì)粒pRNAT—suv2和陰性對(duì)照質(zhì)粒pRNAT—neg轉(zhuǎn)染Ishikawa細(xì)胞，G418篩選穩(wěn)定并有效表達(dá)pRNAT—suv2和pRNAT-neg的克隆。用westernblot檢測(cè)穩(wěn)定表達(dá)克隆中surviyin的干擾效果，并用劃痕實(shí)驗(yàn)、Matrigel體外侵襲實(shí)驗(yàn)和westernblot評(píng)價(jià)穩(wěn)定并有效表達(dá)pRNAT—suv2的細(xì)胞與陰性對(duì)照組細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、侵襲能力以及E一鈣粘蛋白表達(dá)的差異。

13、 結(jié)果(1)穩(wěn)定表達(dá)pRNAT-suv2的細(xì)胞其survivin的表達(dá)水平低于未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和穩(wěn)定表達(dá)pRNAT-neg的細(xì)胞。(2)穩(wěn)定表達(dá)pRNAT—suv2的細(xì)胞其運(yùn)動(dòng)能力和侵襲能力均低于未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和穩(wěn)定表達(dá)pRNAT-neg的細(xì)胞(p

14、表達(dá)可以降低子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲能力，可能與E一鈣粘蛋白的表達(dá)增加有關(guān)。Survivin的異常表達(dá)可能促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。 第四部分子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中EGFR/Ras／Raf／MAPK信號(hào)通路對(duì)survivin表達(dá)的調(diào)控 目的探討子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中EGFR／Ras／Raf／blAPK信號(hào)通路對(duì)survivin表達(dá)的調(diào)控。 方法應(yīng)用人重組生長(zhǎng)因子EGF和TGF-Q分別作用于Ishikawa細(xì)胞，Weste

15、rnblot分析不同時(shí)間MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵分子ERKl／2的磷酸化和survivin蛋白的表達(dá)。并且應(yīng)用特異性的MAPK通路阻斷劑U0126抑制ERKl／2的磷酸化，觀察阻斷MAPK通路后survivin蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果(1)EGF和TGF-Q均迅速誘導(dǎo)了ERKl／2的磷酸化，激活了MAPK通路，并使survivin蛋白表達(dá)增加了8．35倍和9．42倍。(2)應(yīng)用MAPK通路阻斷劑U0126預(yù)處理細(xì)胞則完全抑制了EGF和

16、TGF-Q誘導(dǎo)的ERKl／2磷酸化，阻斷了MAPK通路的激活，并使得EGF和TGF—Q上調(diào)surviyin蛋白表達(dá)的作用消失。 結(jié)論子宮內(nèi)膜癌中EGF和TGF—a能夠通過激活MAPK信號(hào)通路上調(diào)survivin蛋白的表達(dá)。MAPK通路是調(diào)控survivin蛋白表達(dá)的一個(gè)上游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 綜上所述，survivin在子宮內(nèi)膜癌中過度表達(dá)，并可促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖和侵襲，抑制其凋亡。EGFR／Ras／Raf／MAPK信號(hào)