依據(jù)16S rRNA基因和16S-23S rRNA基因間隔區(qū)對鴨疫里默氏菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析.pdf

1、本試驗對鴨疫里默氏菌(RA)1～19型的參考菌株及代表亞型、變異株和未定型的7個分離株共26個菌株的16SrRNA基因以及16S-23SrRNA基因間隔區(qū)(ISR)進(jìn)行了研究，旨在進(jìn)一步明確RA的系統(tǒng)發(fā)育位置，闡明RA16SrRNA基因和ISR的分子特征，并為RA分離株的鑒定、RA感染的快速診斷及流行病學(xué)研究奠定技術(shù)基礎(chǔ)。 用細(xì)菌通用引物擴(kuò)增出RA接近全長的16SrRNA基因，經(jīng)克隆測序后進(jìn)行了序列分析。BLASTN結(jié)果顯示，R

2、A與鴿子里默氏菌、動物潰瘍伯杰氏菌和粘金黃桿菌之間的16SrRNA基因序列同源性最高，這些細(xì)菌在系統(tǒng)發(fā)育樹上共同占據(jù)一個獨立的rRNA分支，結(jié)果進(jìn)一步表明，RA屬于rRNA總科V黃桿菌科的里默氏菌屬。 獲得了鑒定RA的4個分子指標(biāo)。26個RA菌株之間的16SrRNA序列相似性為99.1～100％，而黃桿菌科中所有可用于分析的菌屬內(nèi)，種間序列差異均大于1％小于10％，提示1％以內(nèi)的16SrRNA基因序列差異可作為鑒定RA的判斷標(biāo)準(zhǔn)

3、。用通用引物擴(kuò)增的26個RA菌株16SrRNA基因經(jīng)HaeⅢ酶切后，呈現(xiàn)一致的RFLP圖譜，該圖譜與大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌16SrRNA的理論酶切分析所產(chǎn)生的圖譜具有較大差異，說明RA16SrRNA基因的通用引物PCR-RFLP圖譜具有種特異性。根據(jù)SSCP分析需要設(shè)計引物，從26個RA菌株中均擴(kuò)增出長約335bp的基因片段，這些PCR產(chǎn)物呈現(xiàn)相同的SSCP圖譜，可作為RA的一項特征性指標(biāo)。基于16SrRNA基因可變區(qū)設(shè)計引物，建

4、立了RA的種特異性PCR法，該法具有良好的特異性和敏感性，既可用于快速鑒定RA分離株，亦可用于直接檢測臨床病例，其檢測結(jié)果與傳統(tǒng)方法相符。 對上述26株RA的16S-23SISR進(jìn)行了克隆和測序，所有菌株的ISR長度分布在兩個范圍，分別為495～498bp和573～574bp，血清4、8、14、15和17型參考菌株及7個分離株屬于后者，其ISR比其它菌株多出約76pb的插入序列ISI。所有菌株的16S-23SISR均包含一個tR