A2B5+GL261細(xì)胞裂解物致敏DC疫苗治療小鼠GL261腦膠質(zhì)瘤.pdf

1、[目的]
　　 探討腦腫瘤干細(xì)胞裂解物致敏DC疫苗對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦膠質(zhì)瘤能否發(fā)揮治療作用。
　　 1.建立小鼠GL261腦膠質(zhì)瘤原位模型，探討GL261腦膠質(zhì)瘤的成瘤經(jīng)過(guò)和荷瘤小鼠免疫格局的變化情況；
　　 2.探討GL261細(xì)胞的免疫原性和A285+GL261細(xì)胞的生物學(xué)特征；
　　 3.研究A2B5+GL261細(xì)胞裂解物致敏DC疫苗對(duì)小鼠GL261腦膠質(zhì)瘤的治療作用，及其可能的作用機(jī)制。
　　 [

2、方法]
　　 1.采用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液在體外培養(yǎng)GL261細(xì)胞。采用立體定向注射法將1×105GL261細(xì)胞注入同源C57BL/6小鼠右額葉深部，觀察小鼠的表現(xiàn)和生存時(shí)間。取瀕死小鼠的全腦作病理學(xué)檢查：HE染色和GFAP、Ki-67和CD3免疫組化染色。
　　 2.在C57BL/6小鼠腦內(nèi)種植1×105GL261細(xì)胞后，分別于第4天、第8天、第12天、第16天、第20天、第24天處死3只小鼠，取全腦和脾臟，

3、觀察GL261腦膠質(zhì)瘤的成瘤經(jīng)過(guò)，研究脾指數(shù)、脾細(xì)胞總數(shù)、脾臟T淋巴細(xì)胞的變化情況和腫瘤局部CD3+T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。
　　 3.分別在C57BL/6小鼠和BALB/C-nu裸鼠皮下種植1×106GL261細(xì)胞，觀察和比較皮下成瘤情況。采用20GyX射線輻射滅活GL261細(xì)胞作為疫苗接種到C57BL/6小鼠皮下，預(yù)防性接種組：第0天、第7天兩次在C57BL/6小鼠皮下接種1×106輻射滅活GL261疫苗，第12天在小鼠腦內(nèi)種

4、植1×105GL261細(xì)胞；治療性接種組：第0天在C57BL/6小鼠腦內(nèi)種植1×105GL261細(xì)胞，第7天、第14天、第21天三次在小鼠皮下接種1×106輻射滅活GL261疫苗，比較小鼠的生存時(shí)間和腦內(nèi)成瘤情況。流式檢測(cè)GL261細(xì)胞H-2Kb和H-2I-Ab分子的表達(dá)情況。
　　 4.采用含20ng/mL EGF、20ng/mL bFGF、2％B27的DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)液在體外培養(yǎng)GL261細(xì)胞，流式分選獲取A2B5

5、+和A2B5-GL261細(xì)胞。進(jìn)行體外單細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)，比較A2B5+和A2B5-GL261細(xì)胞的克隆形成能力。進(jìn)行體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)：A2B5+GL261細(xì)胞按照1×104、1×103、1×102細(xì)胞數(shù)量梯度進(jìn)行種植，A2B5-GL261細(xì)胞組按照1×105、1×104、1×103細(xì)胞數(shù)量梯度進(jìn)行種植，比較A2B5+和A2B5-GL261細(xì)胞的成瘤能力。
　　 5.采用含15％FBS、10ng/mL mGM-CSF、10ng/mL

6、 mIL-4的RPMI1640培養(yǎng)液在體外培養(yǎng)小鼠骨髓DC細(xì)胞。采用反復(fù)凍融法裂解A2B5+和A2B5-GL261細(xì)胞，并用以致敏DC制備疫苗。致敏DC與脾臟T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，通過(guò)CFSE/PI流式檢測(cè)作體外殺傷實(shí)驗(yàn)研究。干預(yù)分成兩種：成瘤前干預(yù)第0天在C57BL/6小鼠腦內(nèi)種植1×105GL261細(xì)胞，第2天、第9天、第16天三次在皮下接種含1×106A2B5+或A2B5-GL261細(xì)胞裂解物致敏DC疫苗進(jìn)行治療；成瘤后干預(yù)第0天在C

7、57BL/6小鼠腦內(nèi)種植1×105GL261細(xì)胞，第12天、第19天、第26天三次在皮下接種含1×106A2B5+或A2B5-GL261細(xì)胞裂解物致敏DC疫苗進(jìn)行治療，比較小鼠的生存時(shí)間和腦內(nèi)成瘤情況。采用RT-RCR檢測(cè)A2B5+和A2B5-GL261細(xì)胞內(nèi)gp100和TRP-2基因的表達(dá)情況。
　　 [結(jié)果]
　　 1.C57BL/6小鼠腦內(nèi)種植1×105GL261細(xì)胞，可以獲得百分之百的腦內(nèi)成瘤，小鼠生存時(shí)間為3～

8、4周，重復(fù)性好。GL261腦膠質(zhì)瘤具有很強(qiáng)的侵襲性，能夠模擬人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。
　　 2.C57BL/6小鼠腦內(nèi)種植1×105GL261細(xì)胞后，早期腦內(nèi)無(wú)成形的腦膠質(zhì)瘤，第12天開始出現(xiàn)成形的腦膠質(zhì)瘤，其后腫瘤進(jìn)行性增大，直至小鼠死亡。早期小鼠的免疫系統(tǒng)被激活，表現(xiàn)為脾指數(shù)的上升和脾細(xì)胞總數(shù)的增多；成瘤后小鼠呈現(xiàn)免疫耐受，表現(xiàn)為脾指數(shù)和脾細(xì)胞總數(shù)的恢復(fù)；終末期小鼠的免疫系統(tǒng)被抑制，表現(xiàn)為脾指數(shù)的下降和脾細(xì)胞總數(shù)的減少，Treg細(xì)

9、胞比例上升。剛成形的GL261腦膠質(zhì)瘤內(nèi)有明顯的T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，終末期的GL261腦膠質(zhì)瘤內(nèi)僅有零星的T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　 3.C57BL/6小鼠皮下種植1×106GL261細(xì)胞后，GL261細(xì)胞被包裹局限化或被排斥。預(yù)防性接種輻射滅活GL261疫苗，能夠阻止75％C57BL/6小鼠腦內(nèi)成瘤；治療性接種輻射滅活GL261疫苗，不能延長(zhǎng)小鼠生存時(shí)間。GL261細(xì)胞低表達(dá)H-2Kb和H-2I-Ab分子。
　　 4.無(wú)血清培

10、養(yǎng)GL261細(xì)胞中，A2B5+GL261比例為10.36％。單細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：A2B5+GL261單細(xì)胞克隆形成率為11.5％，A2B5-GL261也能夠增殖，但不能形成克隆。1×103A2B5+GL261即能在C57BL/6小鼠腦內(nèi)成瘤，1×105A2B5-GL261也不能在C57BL/6小鼠腦內(nèi)成瘤。
　　 5.A2B5+和A2B5-GL261細(xì)胞裂解物都能致敏小鼠骨髓DC。A2B5+GL261細(xì)胞裂解物致敏DC誘導(dǎo)的

11、CTL對(duì)A2B5-和A2B5+GL261細(xì)胞都有殺傷作用，A2B5-GL261細(xì)胞裂解物致敏DC誘導(dǎo)的CTL對(duì)A2B5-GL261細(xì)胞有殺傷作用，對(duì)A2B5+GL261細(xì)胞的殺傷作用較弱。成瘤前干預(yù)接種A2B5+GL261細(xì)胞裂解物致敏DC疫苗能夠延長(zhǎng)小鼠生存時(shí)間，并阻止37.5％的小鼠腦內(nèi)成瘤，接種A2B5-GL261細(xì)胞裂解物致敏DC疫苗能夠延長(zhǎng)小鼠生存時(shí)間，但不能阻止小鼠腦內(nèi)成瘤；成瘤后干預(yù)接種A2B5+或A2B5-GL261細(xì)胞

12、裂解物致敏DC疫苗都不能延長(zhǎng)小鼠生存時(shí)間。TRP-2基因在A2B5+GL261細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)明顯高于A2B5-GL261細(xì)胞。
　　 [結(jié)論]
　　 小鼠GL261腦膠質(zhì)瘤原位模型重復(fù)性好，能夠模擬人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，但GL261細(xì)胞具有中等的免疫原性。荷瘤小鼠經(jīng)歷了早期的免疫激活、成瘤后的免疫耐受和終末期的免疫抑制三個(gè)階段。A2B5+GL261細(xì)胞具有腦腫瘤干細(xì)胞樣特征。A2B5+GL261細(xì)胞裂解物致敏DC疫苗在體外和在

13、體內(nèi)的作用，都優(yōu)于A2B5-GL261細(xì)胞裂解物致敏DC疫苗
　　 [創(chuàng)新點(diǎn)]
　　 1.對(duì)GL261腦膠質(zhì)瘤原位模型小鼠免疫格局的變化作了初步探討，并提出荷瘤小鼠的免疫格局經(jīng)歷了三個(gè)階段：早期的免疫激活狀態(tài)，成瘤后的免疫耐受狀態(tài)，以及終末期嚴(yán)重的免疫抑制狀態(tài)。
　　 2.首次報(bào)道采用神經(jīng)膠質(zhì)前體細(xì)胞標(biāo)志A2B5，對(duì)已經(jīng)建系的小鼠GL261腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株內(nèi)的腦腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行了研究，并提出A2B5+GL261細(xì)胞具