胰島素瘤發(fā)病危險因素調(diào)查及mTOR-PRAS40-P70S6K信號通路在其發(fā)病中作用機制研究.pdf

1、胰島素瘤是最常見的胰腺內(nèi)分泌腫瘤,占功能性胰腺內(nèi)分泌腫瘤的70-80％,但由于其年發(fā)病率僅為4/百萬,病例資源的稀缺導(dǎo)致臨床醫(yī)師對其臨床特點及生物學(xué)行為認識不夠透徹,并且也大大限制了對其發(fā)病機制的基礎(chǔ)研究,國內(nèi)外尚無關(guān)于其發(fā)病危險因素的大樣本量流行病學(xué)調(diào)查,其發(fā)病、演進及轉(zhuǎn)移機制目前仍不明了。近年研究發(fā)現(xiàn)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白mTOR參與多種腫瘤的發(fā)生及進展,并且PRAS40在其中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用,mTOR/PRAS40/P70S6K

2、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是否參與胰島素瘤的發(fā)病,PRAS40表達水平是否對mTOR活性及胰島素瘤增殖產(chǎn)生影響,目前仍不明了。
　　 目的:
　　 (1)探索胰島素瘤發(fā)病危險因素及高危人群；
　　 (2)了解mTOR/P70S6K通路在胰島素瘤組織中活化、表達情況；
　　 (3)觀察mTOR及PI3K/mTOR雙重抑制劑對mTOR通路活性及對胰島素瘤細胞增殖、胰島素分泌功能及凋亡的影響；
　　 (4)探討PRA

3、S40表達水平對mTOR活性及胰島素瘤細胞增殖的影響。
　　 方法:
　　 (1)對北京協(xié)和醫(yī)院基本外科2000年1月至2010年1月期間收治的196例胰島素瘤患者病歷資料進行回顧性分析,并以同期收治的233例非腫瘤患者作為對照,進行以醫(yī)院為基礎(chǔ)的病例.對照研究,采用單因素及多因素分析方法評價環(huán)境因素、生活方式、家族史等相關(guān)危險因素是否與胰島素瘤發(fā)病存在關(guān)聯(lián)及聯(lián)系程度大??；
　　 (2)采用RT-PCR法觀察mT

4、OR及P70S6K mRNA在胰島素瘤及正常胰腺組織的表達情況,另外用免疫組織化學(xué)及Western blottting方法,觀察p-mTOR及p-P70S6K在胰島素瘤組織及正常胰腺組織中的表達差異；
　　 (3)分別使用mTOR抑制劑(雷帕霉素)及PI3K/mTOR雙重抑制劑(NVP-BEZ235)干預(yù)胰島素瘤INS-1細胞,RT-PCR及Western blotting觀察抑制劑對該通路關(guān)鍵基因及蛋白表達影響,并采用MTT、

5、流式細胞儀檢測增殖及凋亡、葡萄糖刺激胰島素分泌實驗(GSIS)等方法評價兩種抑制劑對胰島素瘤細胞增殖、胰島素分泌功能及凋亡等影響；
　　 (4)使用PRAS40-siRNA瞬時轉(zhuǎn)染INS-1細胞,Taqman Real time PCR法了解PRAS40沉默效果,Western blotting觀察其對mTOR及P70S6K磷酸化水平的影響,MTT比色法觀察下調(diào)PRAS40表達對INS-1細胞增殖的影響。
　　 結(jié)果:<

6、br>　　 (1)農(nóng)村人口(OR=4.950,P<0.0001)、胰腺內(nèi)分泌腫瘤家族史(OR=16.754,P=0.007)、其他惡性腫瘤家族史(OR=2.360,P=0.037)為胰島素瘤發(fā)病的獨立危險因素,吸煙及飲酒是否為胰島素瘤發(fā)病危險因素需進一步研究驗證；
　　 (2)免疫組化及Western blotting結(jié)果提示p-mTOR及p-P70S6K在胰島素瘤組織中的表達水平明顯高于正常胰腺(胰島)組織,胰島素瘤組織mT

7、OR及P70S6K mRNA水平亦高于正常胰腺組織；
　　 (3)雷帕霉素及NVP-BEZ235可抑制mTOR及其下游P70S6K表達活化,繼而導(dǎo)致細胞G1期阻滯,抑制胰島素瘤細胞INS-1增殖,降低INS-1細胞分泌胰島素及對葡萄糖刺激反應(yīng)能力,同時可促進凋亡,但高濃度雷帕霉素可引起mTORC1的負反饋調(diào)節(jié),導(dǎo)致p-mTOR表達水平的升高,NVP-BEZ235抑制PI3K/mTOR/P70S6K通路活性的能力更強,其抑制細胞增

8、殖及促凋亡能力優(yōu)于雷帕霉素；
　　 (4)使用脂質(zhì)體將PRAS40-siRNA瞬時轉(zhuǎn)染INS-1細胞,轉(zhuǎn)染效果理想,轉(zhuǎn)染沉默PRAS40表達后可促進mTOR活性,mTOR及其下游P70S6K蛋白磷酸化水平增高,繼而促進INS-1細胞增殖。
　　 結(jié)論:
　　 (1)農(nóng)村人口、胰腺內(nèi)分泌腫瘤家族史及其他惡性腫瘤家族史為胰島素瘤發(fā)病的獨立危險因素；
　　 (2)mTOR/P70S6K通路在胰島素瘤中異常激活,