腹部開(kāi)放傷合并海水浸泡大鼠腸屏障功能損害的初步研究.pdf

1、目的: 1.建立腹部開(kāi)放傷合并海水浸泡大鼠模型,觀察海水浸泡后大鼠血漿DAO、D-乳酸、LPS及腸道細(xì)菌易位的變化和腸黏膜組織形態(tài)學(xué)改變,確定大鼠腸屏障功能變化情況。 2.探討腹部開(kāi)放傷合并海水浸泡大鼠腸屏障功能損害的機(jī)制：觀察腸蠕動(dòng)速率的變化,腸組織MDA、SOD的含量,血漿TNF-α、IL-6的水平,腸道內(nèi)容物SIgA、血漿IgA的變化及腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡的情況。 方法: 1.選擇健康雄性Wistar

2、大鼠50只,體重230±20g,清潔級(jí),按照隨機(jī)化原則分組,每組10只,分組情況如下:A組：腹部開(kāi)放傷合并海水浸泡組(腹腔開(kāi)放傷后浸泡于人工海水中);B組：?jiǎn)渭兏共块_(kāi)放傷組(單純腹部開(kāi)放傷后直接觀察而不浸泡于海水或生理鹽水);C組：?jiǎn)渭兒Ｋ萁M(大鼠麻醉后未行任何手術(shù),直接將腹部浸泡于人工海水中);D組：腹部開(kāi)放傷合并生理鹽水浸泡組(腹腔開(kāi)放傷后浸泡于生理鹽水中);E組：正常對(duì)照組(未行任何處理)。 2.在腹部開(kāi)放性創(chuàng)傷和人工

3、海水浸泡雙重應(yīng)激情況下,在應(yīng)激1小時(shí)后,分別用分光光度法檢測(cè)腹部開(kāi)放傷合并海水浸泡大鼠血漿DAO和D-乳酸；動(dòng)態(tài)濁度法檢測(cè)血漿LPS;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臟器細(xì)菌定量培養(yǎng)觀察細(xì)菌易位情況。 3.按Haglund等評(píng)估小腸黏膜上皮損傷指數(shù)的方法,光學(xué)顯微鏡下觀察腸黏膜組織病理學(xué)改變,透射電鏡下觀察腸黏膜組織超微結(jié)構(gòu)變化。 4.采用活性炭標(biāo)記法測(cè)定大鼠腸道蠕動(dòng)速率,分光光度法檢測(cè)腸組織MDA和SOD,酶聯(lián)免疫吸附測(cè)試(ELISA)法檢測(cè)

4、血漿TNF-α、IL-6、:IgA和腸道內(nèi)容物SIgA。 結(jié)果: 1.血漿D-乳酸活性檢測(cè)：腹部開(kāi)放傷合并海水浸泡組(A組)大鼠血漿D-乳酸活性(7.63±0.72mg/L)、單純腹部開(kāi)放傷組(B組)血漿D-乳酸活性(5.46±0.57mg/L)、腹部開(kāi)放傷合并生理鹽水浸泡組(D組)血漿D-乳酸活性(4.97±0.95mg/L)較正常對(duì)照組(E組)大鼠血漿D-乳酸活性(4.06+0.39mg/L)顯著升高,單純海水浸泡組

5、(C組)血漿D-乳酸活性(3.89±0.55mg/L)較E組無(wú)顯著差異；與B組比較,D組血漿D-乳酸活性無(wú)顯著差異,A、C組血漿D-乳酸活性有顯著差異。 2.血漿DAO活性檢測(cè)：大鼠血漿DAO活性A組(6.24±1.54 KU/L)、B組(3.57±1.65 KU/L)、C組(0.42±0.04KU/L)、D組(3.40±1.58KU/L)較E組(0.36±0.04 KU/L)均顯著升高；而與B組比較,D組無(wú)顯著差異,A、C組有

6、顯著差異。 3.血漿內(nèi)毒素水平檢測(cè)：大鼠血漿內(nèi)毒素水平A組(486.5±116.1 pg/ml)、B組(344.5±51.5 pg/ml)、D組(338.7±54.4 pg/ml)較E組(23.5±10.4 pg/ml)顯著升高,C組(23.0±11.7 pg/ml)與E組無(wú)顯著差異；與B組比較,A、C組血漿內(nèi)毒素有顯著差異,D組無(wú)顯著差異。 4.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臟器細(xì)菌定量培養(yǎng)：結(jié)果顯示,正常動(dòng)物在無(wú)菌條件下采集的血漿標(biāo)本和其

7、他臟器勻漿液標(biāo)本經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)后,沒(méi)有菌落出現(xiàn)；A、B、D組血漿、肝臟及腸系膜淋巴結(jié)細(xì)菌培養(yǎng)后均可見(jiàn)大量菌落出現(xiàn)；與B組相比,A組和D組血培養(yǎng)及肝臟培養(yǎng)菌落數(shù)顯著上升,且A組結(jié)果最高,腸系膜淋巴結(jié)培養(yǎng),D組菌落數(shù)顯著減少,A組菌落數(shù)無(wú)明顯差異。 5.小腸黏膜組織形態(tài)學(xué)觀察及評(píng)分:C、E組腸黏膜未見(jiàn)損傷,光鏡下黏膜結(jié)構(gòu)完整,小腸絨毛上皮完整、細(xì)胞排列整齊；A、B、D組均引起多部位的不同程度的腸道損傷,小腸絨毛頂端水腫、間隙增寬；部分區(qū)

8、域上皮細(xì)胞萎縮,細(xì)胞核固縮、碎裂,胞漿嗜酸性變；固有膜毛細(xì)血管擴(kuò)張,紅細(xì)胞凝聚；淋巴管擴(kuò)張,淋巴管內(nèi)淋巴細(xì)胞聚集。小腸黏膜損傷評(píng)分值分別為:A組(5.10±0.74)；B組(2.20±0.78)；C組(0.20±0.42)；D組(2.50±0.71)；E組(0.20±0.42)。A、B、D組損傷程度評(píng)分顯著高于C、E組；與B組比較,A組腸黏膜組織損傷程度明顯加重,B組和D組間無(wú)顯著差異。 6.小腸組織電鏡觀察：透射電鏡下,C、E

9、組大鼠腸上皮細(xì)胞微絨毛結(jié)構(gòu)完整,排列整齊,胞漿內(nèi)含大量線粒體,結(jié)構(gòu)完整,嵴清晰；A、B、D組腸道損傷后腸上皮細(xì)胞微絨毛變短,排列不整齊,線粒體腫脹明顯,部分嵴溶解消失,較大空泡形成；部分細(xì)胞核固縮,核膜表面凹凸不平,染色質(zhì)集聚于核膜周邊形成新月形或環(huán)形,呈凋亡的形態(tài)改變。 7.腸蠕動(dòng)速率檢測(cè)：檢測(cè)腸蠕動(dòng)速率活性炭標(biāo)記法簡(jiǎn)單準(zhǔn)確。大鼠腸道蠕動(dòng)速率A組(15.36±1.63％)顯著下降,其蠕動(dòng)速率只為E組(77.94±3.68％)的

10、20％。B組(22.94±0.95％)、C組(32.34±3.58％)、D組(21.30±3.56％)腸蠕動(dòng)速率顯著低于E組,與E組比較,腹部開(kāi)放傷及海水浸泡能夠非常顯著地抑制腸道蠕動(dòng)功能；與B組比較,D組無(wú)顯著差異,A、C組抑制腸道蠕動(dòng)功能有顯著差異。 8.血漿TNF-α濃度檢測(cè)：大鼠血漿TNF-α濃度A組(105.20±21.17 Pg/ml)、B組(68.43±20.09 Pg/ml)、C組(67.77±16.57 Pg/

11、ml)、D組(57.25±14.21 Pg/ml)較E組(40.24±10.29 Pg/ml)顯著升高；而與B組比較,A組血漿TNF-α濃度顯著升高,C、D組無(wú)顯著差異。 9.血漿IL-6濃度檢測(cè)：大鼠血漿IL-6濃度A組(207.76±42.26 Pg/ml)、B組(136.37±27.57 Pg/ml)、D組(143.58±33.76 Pg/ml)較E組(94.98±17.84 Pg/ml)顯著升高,C組(107.02±26

12、.09 Pg/ml)較E組無(wú)顯著差異；而與B組比較,A、C組血漿IL-6濃度有顯著差異,D組無(wú)顯著差異。 10.腸內(nèi)容物SIgA含量檢測(cè)：與E組(99.6±16.7 mg/L)比較,A組(32.26±7.57mg/L)、B組(65.08±10.07 mg/L)、D組(45.84±9.41 mg/L)腸道內(nèi)容物SIgA含量顯著減少,C組(89.98±11.14 mg/L)無(wú)顯著差異；與B組比較,A、C、D組腸道內(nèi)容物SIgA含量有

13、顯著差異。 11.血漿IgA含量檢測(cè)：與E組(61.73±17.44 mg/L)比較,A組(32.10±10.84 mg/L)、B組(43.62±10.12 mg/L)、D組(38.68±12.98 mg/L)血漿IgA含量顯著減少,C組(65.84±8.18 mg/L)無(wú)顯著差異；與B組比較,A、D組無(wú)顯著差異,C組有顯著差異。 12.大鼠腸組織MDA含量檢測(cè)：腹部開(kāi)放海水浸泡后,腸上皮細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)造成腸組織MDA含量

14、明顯增加；與E組(2.76±1.97 nmol/mg Pro)比較,A組(4.70±1.17 nmol/mg Pro)、B組(3.14±0.65 nmol/mg Pro)、D組(4.37±1.32 nmol/mgpro)大鼠腸組織MDA含量顯著升高,C組(2.13±1.08 nmol/mg pro)大鼠腸組織MDA含量無(wú)顯著差異；與B組比較,A、C、D組大鼠腸組織MDA含量有顯著差異。 13.大鼠腸組織SOD含量檢測(cè)：腹部開(kāi)放傷

15、合并海水浸泡后,腸上皮細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)造成腸組織SOD含量明顯減少：與E組(4.31±1.40 NU/mg pro)比較,A組(1.57±0.34 NU/mg pro)、D組(2.05±0.43 NU/mg pro)大鼠腸組織SOD含量顯著減少,B組(3.43±1.33 NU/mg pro)、C組(4.09±1.70 NU/mg pro)大鼠腸組織SOD含量無(wú)顯著差異；與B組比較,A、D組大鼠腸組織SOD含量顯著減少,C組大鼠腸組織SOD含

16、量無(wú)顯著差異。 14.小腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡檢測(cè):TUNEL法顯示,凋亡細(xì)胞主要位于小腸絨毛頂部,且隨致傷程度的加重有由上向下發(fā)展的趨勢(shì)。C、E組小腸黏膜絨毛頂部可見(jiàn)少量陽(yáng)性凋亡細(xì)胞。A、B、D組小腸黏膜絨毛及隱窩上皮細(xì)胞凋亡明顯增多。小腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)的變化分別為:A組(45.60±7.0),B組(22.10±3.6),C組(5.10±0.6),D組(24.66±3.5),E組(4.51±0.7)。C、E組小腸黏膜上皮細(xì)胞

17、凋亡指數(shù)呈現(xiàn)低水平；A、B、D組小腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)均顯著高于C、E組；與B組比較,A組小腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著增高,D組無(wú)顯著差異。 結(jié)論： 1.大鼠腹部開(kāi)放傷合并海水浸泡動(dòng)物模型制作成功；腹部開(kāi)放傷及腹腔海水浸泡雙重應(yīng)激可引起IBFD,腸黏膜通透性增高；出現(xiàn)腸源性內(nèi)毒素血癥和細(xì)菌易位,成為創(chuàng)傷后腸源性感染及多器官功能障礙綜合征(MODS)發(fā)生的原因之一。 2.腹部開(kāi)放傷合并海水浸泡大鼠腸道蠕動(dòng)功能明顯

18、受到抑制,出現(xiàn)腸道動(dòng)力障礙,腸道傳輸功能受損是腸源性內(nèi)毒素血癥和細(xì)菌易位的原因之一。 3.腹部開(kāi)放傷合并海水浸泡可導(dǎo)致大鼠腸黏膜屏障功能受損,TNF-α、IL-6等炎癥介質(zhì)及氧自由基參與了腹部開(kāi)放傷合并海水浸泡繼發(fā)性炎癥反應(yīng)過(guò)程及腸道黏膜細(xì)胞損傷。 4.腹部開(kāi)放傷合并海水浸泡大鼠腸道免疫功能下降。大量的腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡是細(xì)菌易位和腸源性內(nèi)毒素血癥的重要機(jī)制之一。腸道局部免疫功能的紊亂可能是引起整個(gè)機(jī)體免疫功能紊亂的原因