BMP9聯(lián)合Wnt3a誘導(dǎo)C3H10T1-2細(xì)胞向心肌細(xì)胞樣細(xì)胞分化的研究.pdf

1、第一部分?jǐn)U增重組腺病毒GFP、Wnt3a、BMP9并分別轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞
　　目的：擴(kuò)增能高度表達(dá)GFP、Wnt3a、BMP9蛋白的重組腺病毒，并檢測(cè)分別轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞后的穩(wěn)定性。
　　方法：復(fù)蘇HEK293細(xì)胞并培養(yǎng)，待其增殖生長(zhǎng)至約培養(yǎng)瓶底面積的70％～80％，進(jìn)行反復(fù)傳代兩次后，向細(xì)胞中分別加入適量的AdEasyGFP、AdEasyWnt3a、AdEasyBMP9原液，搖晃均勻后培養(yǎng)48～72h觀(guān)

2、察細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯的改變后，即可收集細(xì)胞懸液。于倒置相差顯微鏡下觀(guān)察復(fù)蘇培養(yǎng)的C3H10T1/2細(xì)胞，待其生長(zhǎng)鋪滿(mǎn)至約培養(yǎng)瓶底面積的70％時(shí)，加入適量已成功收集的腺病毒液，48h后利用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)分別觀(guān)察腺病毒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞生長(zhǎng)變化及轉(zhuǎn)染效率。
　　結(jié)果：1、AdEasyGFP、AdEasyWnt3a、AdEasyBMP9在HEK293細(xì)胞中反復(fù)擴(kuò)增后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，即收集到了能夠高度表達(dá)GFP、Wnt3a、BM

3、P9蛋白的腺病毒液。
　　2、鏡下觀(guān)察經(jīng)BMP9、Wnt3a及二者聯(lián)合轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞1周后，可見(jiàn)BMP9組、Wnt3a聯(lián)合BMP9組細(xì)胞呈現(xiàn)纖維樣生長(zhǎng)排列，方向漸趨于一致，連接緊密；Wnt3a組細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形生長(zhǎng)，排列則較為紊亂。
　　3、利用流式細(xì)胞術(shù)得到經(jīng)GFP、Wnt3a、BMP9及二者聯(lián)合轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞48h后的轉(zhuǎn)染效率均約為60％。
　　結(jié)論：AdEasyGFP、AdEasyWnt3a、

4、AdEasyBMP9原液在HEK293細(xì)胞中反復(fù)擴(kuò)增后可以收集到高度表達(dá)的腺病毒液；分別轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞后各組細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)良好，并可獲得較高和較穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染效率。
　　第二部分 Wnt3a單獨(dú)及聯(lián)合BMP9誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞向心肌細(xì)胞樣細(xì)胞分化的作用
　　目的：研究經(jīng)Wnt3a單獨(dú)以及Wnt3a聯(lián)合BMP9轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞后其向心肌細(xì)胞樣細(xì)胞分化的初步作用。
　　方法：將C3H10T1/2細(xì)胞

5、隨機(jī)分為5組：①空白組；②GFP組；③Wnt3a組；④BMP9組；⑤Wnt3a聯(lián)合 BMP9組。AdEasyGFP、AdEasyWnt3a、AdEasyBMP9分別轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞3周后，利用Western blot和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞中縫隙連接蛋白43（Cx43）、心肌肌鈣蛋白T（cTnT）的表達(dá)差異；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)各組細(xì)胞中 GATA結(jié)合蛋白4（GATA4）、心肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2C（MEF2C

6、）的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:C3H10T1/2細(xì)胞經(jīng)腺病毒轉(zhuǎn)染3周后仍可穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白。Western blot和 qRT-PCR結(jié)果顯示W(wǎng)nt3a組細(xì)胞心肌特異性蛋白Cx43、cTnT，基因GATA4、 MEF2C的表達(dá)量與空白組比較無(wú)明顯差異；Wnt3a聯(lián)合BMP9組細(xì)胞中Cx43、cTnT、GATA4、MEF2C的表達(dá)量顯著高于空白組、GFP組和Wnt3a組，而與單獨(dú)BMP9組相比無(wú)顯著性差異。
　　結(jié)論：Wnt3