PFT-α和BMP-2聯合誘導大鼠BMMSCs向心肌樣細胞分化的研究.pdf

1、研究背景
　　缺血性心臟病(IschemiaHeartDisease,IHD)引發(fā)的心力衰竭(HeartFailure,HF)呈逐年上升趨勢?；颊呷绻麤]能得到及時有效的治療,心肌細胞則會出現大范圍地變性、壞死,從而引起各種并發(fā)癥和嚴重后果的發(fā)生,嚴重威脅著人類的生命和生活質量。一般認為,心肌細胞是終末細胞,損傷后不能再生,即使能夠再生,每年更新率不到1％。一旦出現心肌組織大范圍受損,目前的藥物治療只能控制癥狀,延緩病情的惡化,并不

2、能修復和根治終末期心衰。心臟移植是一種有效的治療方法,但存在供體來源有限,免疫排斥,費用昂貴等一系列問題,不能廣泛應用于臨床,因此尋找新的治療方法一直是研究人員追尋的目標。細胞移植成為近年來治療IHD的熱點,并飛速發(fā)展。干細胞誘導分化并用于治療心肌梗死的臨床研究正在如火如荼的進行中,但其分化率較低仍是目前需要解決的主要問題。
　　研究目的
　　1.探討體外分離、培養(yǎng)和純化BMMSCs的方法并改進技術。
　　2.研究PF

3、T-α和BMP-2聯合誘導BMMSCs向心肌樣細胞分化的作用。
　　研究方法
　　1.BMMSCs體外分離、培養(yǎng)及鑒定:沖洗大鼠四肢長骨得骨髓沖洗液,采用差速貼壁法和密度梯度離心法相結合的方法分離出BMMSCs,通過傳代培養(yǎng)來純化細胞。流式細胞計數法測定細胞表面陰性抗原CD45和陽性抗原CD44、CD29表達情況。顯微鏡下動態(tài)觀察細胞的生長狀況,記錄形態(tài)并拍照。
　　2.PFT-α和BMP-2聯合誘導BMMSCs向心肌

4、樣細胞分化作用的測定:選取第4代BMMSCs進行誘導分化。實驗分組如下:Control組(完全培養(yǎng)液)、PFT-α組(20μmol/L)、BMP-2組(10μg/L)、PFT-α+BMP-2組(PFT-α:20μmol/L,BMP-2:10μg/L)。前3組誘導24h后換完全培養(yǎng)液,PFT-α+BMP-2組誘導48h后換完全培養(yǎng)液。誘導結束即刻用流式細胞計數法測定細胞凋亡情況。免疫熒光染色法和蛋白免疫印跡法測定細胞Cx43、cTnI表達

5、情況;流式細胞計數法測定各組心肌樣細胞的分化。
　　研究結果
　　1.體外培養(yǎng)BMMSCs的形態(tài)學特征及鑒定:即刻分離的原代細胞體積小,透亮,折光性強;3d時細胞貼壁,形態(tài)多樣,表現為橢圓形、星形、梭形、不規(guī)則形等;1w時細胞排列規(guī)則,呈集落樣成長;細胞傳代后的體積增大,表現為長梭形,核漿比增大。流式細胞計數法測定BMMSCs表面抗原陽性率,結果分別為:CD29(93.77±2.440)%;CD44(93.03±1.10)%

6、;CD45(1.97±0.74)%。
　　2.PFT-α和BMP-2聯合誘導BMMSCs向心肌樣細胞分化作用:誘導后細胞凋亡結果:Control組、PFT-α組、BMP-2組和PFT-α+BMP-2組Q3分別為(89.34±3.18)%、(55.55±5.32)%、(80.44±4.34)%、(70.33±2.61)%。BMP-2組與Control組比較無統計學差異(P≥0.05),其余各組之間均存在統計學差異(P<0.01)。W

7、esternBlot測定結果,Cx43表達:1w時,Control組、PFT-α組、BMP-2組和PFT-α+BMP-2組灰度值比值分別為(0.153±0.068)、(0.313±0.036)、(0.263±0.024)、(0.394±0.054);Control組低于誘導組(P<0.01),PFT-α+BMP-2組高于其它實驗組(P<0.05),PFT-α組和BMP-2組比較無統計學差異(P≥0.05)。4w時,Control組、PF

8、T-α組、BMP-2組和PFT-α+BMP-2組灰度值比值分別為(0.342±0.038)、(0.763±0.053)、(0.627±0.083)、(1.065±0.048);Control組低于誘導組(P<0.01),PFT-α+BMP-2組高于其它實驗組(P<0.05)。cTnI表達:1w時,Control組、PFT-α組、BMP-2組和PFT-α+BMP-2組灰度值比值分別為(0.034±0.001)、(0.263±0.026)、

9、(0.193±0.033)、(0.394±0.045);Control組低于誘導組(P<0.01),PFT-α+BMP-2組高于其它實驗組(P<0.05)。4w時,Control組、PFT-α組、BMP-2組和PFT-α+BMP-2組灰度值比值分別為(0.072±0.014)、(0.646±0.043)、(0.546±0.029)、(0.877±0.037);Control組低于誘導組(P<0.01),PFT-α+BMP-2組高于其它實

10、驗組(P<0.05)。免疫熒光染色鑒定結果:Cx43表達:1w時,Control組無表達,誘導組微弱表達;4w時,Control組微弱表達,誘導組表達增強。cTnI表達:1w時,Control組無表達,誘導組微弱表達;4w時,Control組仍無表達,誘導組表達增強。分化率結果:Control組、PFT-α組、BMP-2組和PFT-α+BMP-2組分化率分別為(2.04±1.63)%、(26.96±1.90)%、(16.53±2.63)

11、%、(38.48±2.44)%;Control組低于誘導組(P<0.01),PFT-α+BMP-2組高于其他實驗組(P<0.01)。
　　研究結論
　　1.聯合差速貼壁法和密度梯度離心法能夠獲得大量BMMSCs,通過傳代能夠得到純度較高的BMMSCs。
　　2.PFT-α聯合BMP-2誘導BMMSCs可使其向心肌樣細胞分化,并表現出與正常心肌細胞類似的生物學特性,其細胞分化率明顯高于PFT-α或BMP-2單獨誘導。PF