體外心肌樣微環(huán)境誘導(dǎo)P19細胞向心肌細胞分化.pdf

1、一般認為成熟的心肌細胞為終末分化細胞,無生長和繁殖能力,因心肌梗死而損傷的心肌組織也就不能得到修復(fù),由此造成心肌細胞數(shù)量下降,是引起心力衰竭等心臟疾病的重要原因。目前細胞移植為病損心肌細胞的修復(fù)提供了一種全新的治療方案。有學(xué)者提出用骨骼肌細胞代替心肌細胞,但是研究發(fā)現(xiàn):移植骨骼肌細胞可能會使部分患者患上嚴(yán)重的心律不齊并導(dǎo)致患者的死亡。胚胎干細胞的成功分離,為壞死心肌細胞的修復(fù)帶來了希望。胚胎干細胞是“全能”的細胞,可以分化為人體所有種類

2、的細胞。因此,理論上講,在適當(dāng)?shù)臈l件下,胚胎干細胞可以分化為心肌細胞。近年來,不少研究致力于探討誘導(dǎo)胚胎干細胞向心肌細胞分化的條件。目前認為,干細胞進入微環(huán)境后會對相應(yīng)的各種物理或化學(xué)信號做出反應(yīng),即環(huán)境誘導(dǎo)分化。多種細胞的體內(nèi)外分化研究表明,體內(nèi)心肌環(huán)境或體外“心肌樣”環(huán)境比單純的化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)更為重要。鑒于此,本實驗應(yīng)用P19細胞與乳鼠心肌細胞進行直接接觸培養(yǎng)或用“心肌樣”環(huán)境條件培養(yǎng)P19細胞,運用形態(tài)學(xué)技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù),研究P

3、19細胞在心肌環(huán)境中的生長、分化狀態(tài),探討環(huán)境因素對P19細胞分化的作用及分化機制,為P19細胞體內(nèi)分化機制及細胞移植的研究奠定基礎(chǔ)。
　　 一 P19細胞傳代及懸浮培養(yǎng)
　　 P19細胞常規(guī)復(fù)蘇傳代培養(yǎng),取傳代4代以上的P19細胞,以5×105/mL,密度接種在鋪有低熔點瓊脂的培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)4天,形成細胞聚集體EBs(embryonic bodies,EBs)。用倒置顯微鏡觀察P19細胞生長分化情況,以及懸浮培養(yǎng)4天后

4、形成EBs的情況。
　　 結(jié)果顯示:P19細胞傳代后約2h開始貼壁生長,細胞呈圓形,24h后長滿瓶底的50％左右,細胞呈扁平不規(guī)則形,48h細胞生長密集。P19細胞在鋪有低熔點瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中懸浮培養(yǎng)48h后,細胞聚集形成細胞團,較均勻規(guī)則,懸浮生長。至第4天形成球形EBs。
　　 二乳鼠心肌細胞的分離培養(yǎng)及鑒定
　　 取出生1-3天的SD大鼠乳鼠,75％酒精消毒皮膚,開胸取出心室肌組織剪成1mm3的小塊,用

5、胰酶和EDTA消化,直至組織消化完全,收集消化液過濾、離心、重懸后,通過差速貼壁一次和加入0.1mmol/LBrdU來純化心肌細胞。48h后換去含BrdU的培養(yǎng)基,以后隔天換液,倒置顯微鏡觀察細胞變化。培養(yǎng)3天后心肌細胞呈梭形、多角形等不規(guī)則形態(tài),伸出突起相互連接交織成網(wǎng),并出現(xiàn)成片同化搏動,頻率多為60-120次/分。
　　 cTnT抗體免疫細胞化學(xué)染色顯示:心肌細胞胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色絲狀結(jié)構(gòu)。心肌細胞純度鑒定:乳鼠心肌細胞培養(yǎng)

6、72h,cTnT陽性率為70％。
　　 三體外心肌微環(huán)境定向誘導(dǎo)P19細胞向心肌細胞分化
　　 1、P19細胞和乳鼠心肌細胞共培養(yǎng)
　　 用BrdU標(biāo)記P19細胞,BrdU標(biāo)記濃度為15μmol/L,標(biāo)記時間為48h,免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示:細胞核標(biāo)記為棕黃色,陽性率為50％。
　　 將4×105/mL的乳鼠心肌細胞與1×103/mLP19細胞共培養(yǎng)7、10天,用cTnT抗體進行免疫細胞化學(xué)染色,結(jié)果顯示:

7、心肌細胞胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色絲狀結(jié)構(gòu),部分P19細胞的細胞質(zhì)、細胞核均呈棕黃色,表明部分P19細胞向心肌細胞分化,且隨培養(yǎng)時間延長陽性細胞數(shù)增加。用WesternBlotting技術(shù)檢測cTnT和connexin43(Cx43)結(jié)果顯示:共培養(yǎng)組和單獨培養(yǎng)乳鼠心肌細胞組結(jié)果比較(P＜0.01),有統(tǒng)計學(xué)意義。且隨培養(yǎng)時間延長表達增高(P＜0.01),有統(tǒng)計學(xué)意義。提示共培養(yǎng)組中cTnT和Cx43的表達量均高于單獨培養(yǎng)心肌細胞組,且增多的部分

8、主要來自P19細胞。
　　 2、心肌細胞裂解液和心肌細胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)P19細胞
　　 P19細胞懸浮培養(yǎng)至第4天形成EBs,用心肌細胞裂解液和心肌細胞條件培養(yǎng)液各分別培養(yǎng)EBs至7、10天,完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的EBs做為對照,Western Blotting結(jié)果顯示:心肌細胞裂解液組和心肌細胞條件培養(yǎng)液組cTnT和Cx43的表達均高于對照組(P＜0.05),結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義。且心肌細胞裂解液組cTnT和Cx43的表達高于心

9、肌細胞條件培養(yǎng)液組(P＜0.05),結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義。隨培養(yǎng)時間延長表達增高(P＜0.01),有統(tǒng)計學(xué)意義。免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示:Ebs邊緣的部分細胞的細胞質(zhì)中可見cTnT呈陽性表達。
　　 3、共培養(yǎng)組、心肌細胞裂解液組和心肌細胞條件培養(yǎng)液組免疫細胞化學(xué)cTnT陽性結(jié)果
　　 培養(yǎng)至第10天,P19細胞與乳鼠心肌細胞共培養(yǎng)組,P19細胞cTnT陽性高于心肌細胞條件培養(yǎng)液組和心肌細胞裂解液組(P＜0.05),且心肌細胞裂

10、解液組高于心肌細胞條件培養(yǎng)液組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論
　　 1、與心肌細胞共培養(yǎng)、心肌細胞條件培養(yǎng)液和心肌細胞裂解液三種培養(yǎng)方法,均可在體外模擬心肌微環(huán)境誘導(dǎo)P19細胞向心肌細胞定向分化,表達心肌細胞特異cTnT和Cx43,且表達量隨培養(yǎng)時間延長而逐漸增高。
　　 2、共培養(yǎng)條件下,cTnT陽性的P19細胞數(shù)明顯高于心肌細胞條件培養(yǎng)液組和心肌細胞裂解液組,且分化的P19細胞與心肌細胞相連并共同搏動,表明機