低分子肝素分子量測定用對照品的研制.pdf

1、低分子肝素（low molecular weight heparin，LMWH）是肝素經(jīng)化學(xué)或肝素酶降解或物理分級方法制備而成的肝素片段或組分，其平均分子量在8000以下，小于8000的組分不少于60％，抗FXa活性不低于70IU/mg，抗FXa/抗FⅡa不小于1.5。LMWH與肝素鈉主體結(jié)構(gòu)一致，是由艾杜糖醛酸或葡糖醛酸與氨基葡糖以及它們的硫酸化和乙?；苌锝M成的多糖鏈混合物為雙糖單位，以(1→4)糖苷鍵連接而成。近30年來臨床實踐

2、證明，LMWH是優(yōu)良的抗凝抗血栓藥物，與肝素鈉相比抗血栓活性相當(dāng)，但安全性更高。
　　 我國是世界肝素第一生產(chǎn)大國，但目前的狀況是80％以上的肝素產(chǎn)量以原料藥形式出口，出口的肝素原料藥經(jīng)加工后變成價格更高的LMWH制劑返銷回國。我國雖然已有十余個廠家生產(chǎn)LMWH制劑，但國內(nèi)LMWH質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與國外相比明顯較低，主要滿足低分子肝素定義中分子量及活性的要求，未按工藝進行分類，而不同工藝制備的LMWH有不同的末端結(jié)構(gòu)，不同的工藝相關(guān)雜質(zhì)

3、，不同的平均分子量及分布，這些都影響低分子肝素的活性及體內(nèi)過程。因此，參照國外標(biāo)準(zhǔn)，并結(jié)合國情，盡快提高國內(nèi)LMWH質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)十分必要。分子量及分布是LMWH質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的的一個重要指標(biāo)。目前，還沒有國產(chǎn)LMWH分子量測定用對照品，只有歐洲藥典（European Pharmacopoeia,EP）LMWH分子量測定用對照品，WHO LMWH分子量測定用對照品(International Reference Preparation LMWH f

4、or molecular weight calibration)和美國藥典(United States Pharmacopoeia,USP)依諾肝素鈉分子量測定用對照品。本課題致力于研制國產(chǎn)LMWH分子量對照品，研制了系列窄分布的LMWH分子量對照品和附帶一寬分布標(biāo)樣表的寬分布的LMWH分子量對照品，并將兩種對照品分別與WHO和USP對照品的測定結(jié)果進行了對比。
　　 本研究取得的結(jié)果和結(jié)論有以下幾個方面：
　　 1本課

5、題研制了系列窄分布的LMWH分子量測定用對照品
　　 系列自制窄分布LMWH分子量對照品Mp分別為：1400，1850，2328，2863，5714，7768，10443。7個自制窄分布分子量對照品與USP依諾肝素鈉分子量對照品的校正曲線基本重合在一起，分別用自制窄分布對照品和USP依諾肝素鈉分子量對照品測定2個不同批次的依諾肝素鈉、USP依諾肝素鈉分子量系統(tǒng)適用性對照品以及EPLMWH分子量對照品的分子量，結(jié)果表明兩種對照品測

6、定各樣品的Mw相差不大于50，證明制備的系列窄分布樣品可以作為LMWH的分子量測定用對照品。
　　 分子量在6000以下的5個窄分布LMWH分子量測定用對照品(1400，1850，2328，2863，5714)的制備方法是以依諾肝素鈉為原料，經(jīng)Biogel P10分離得到。Biogel P10分離依諾肝素鈉可見小分子量部分有鋸齒狀的峰，分別收集相應(yīng)的峰即可得到6000以下窄分布的系列對照品。
　　 6000以上的2個窄分

7、布LMWH分子量測定用對照品(7768，10443)是以自制的（化學(xué)β消除方法）MMWH(Mp8929)為原料，經(jīng)Biogel P10二次分離得到。本課題還嘗試了以SuperdexG75、SephadexG75、UltragelACA44為層析介質(zhì)分離肝素鈉，Sephadex G75為層析介質(zhì)分離55％分級醇沉的肝素鈉樣品和超濾分離在10kDa和5kDa間的組分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論選擇何種原料和層析介質(zhì)都無法得到類似分離依諾肝素鈉的鋸齒狀峰，

8、且用以上方法得到的樣品產(chǎn)率和RI響應(yīng)值都較低。最后選擇產(chǎn)率及RI相應(yīng)值較高的MMWH為原料，經(jīng)Biogel P10二次分離后的組分作為7000～11100窄分布LMWH分子量對照品。該法制得的對照品與USP依諾肝素鈉窄分布分子量對照品比較峰仍較寬，采用SAX-HPLC和IPRP-HPLC進一步分離自制7000～11100的窄分布LMWH分子量對照品，期望可以得到成分更單一的組分。結(jié)果，SAX-HPLC和IPRP-HPLC可以將依諾肝素鈉

9、小分子量的組分進一步分離成更單一的組分，但無法對分子量在7000～11100的組分進一步分離。
　　 2研制了附帶一寬分布標(biāo)樣表的寬分布LMWH分子量對照品．
　　 利用肝素鈉酶Ⅰ降解肝素鈉得到寬分布LMWH作為寬分布LMWH分子量對照品，附帶的寬分布標(biāo)樣表是由分子量從600～18000的18個分子量與相應(yīng)的累積百分面積組成，根據(jù)寬分布標(biāo)樣表18個點的累積百分面積確定對應(yīng)寬分布對照品的保留時間，將保留時間與表中對應(yīng)分子量

10、的對數(shù)值進行3次曲線方程擬合，得到校正曲線并進行分子量計算。自制寬分布分子量對照品與WHO分子量對照品UV和RI圖譜相似，兩種對照品得到的校正曲線幾乎重合在一起。用WHO LMWH分子量對照品和自制的寬分布分子量對照品分別測定7種LMWH肝素鈉分子量，兩者的測定結(jié)果不大50，說明制備的樣品可以作為寬分布LMWH分子量對照品測定各LMWH分子量。
　　 EPLMWH分子量對照品需要RI和UV聯(lián)用，專用GPC軟件，而本課題制備的兩種