cFLIP在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其在Luteolin誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、第一部分：cFLIP在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)以及其臨床意義 目的：Fas(Apo-1，CD95)信號(hào)通路在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、維持機(jī)體免疫監(jiān)視功能中發(fā)揮著重要作用。雖然頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(Head and neck squanlous cellcarcinoma，HNSCC)細(xì)胞均不同程度地表達(dá)Fas蛋白，但是，體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)證實(shí)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞對(duì)Fas受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡并不敏感，這意味著在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中可能存在著可以抑

2、制Fas受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的因子。cFLIP(細(xì)胞型FLICE樣抑制蛋白cellular FLICE-like inhibitory protein，cFLIP)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類新型凋亡調(diào)控蛋白，它可以抑制Fas及其它死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并且其表達(dá)水平與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在一定的相關(guān)性。而關(guān)于cFLIP在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)的研究尚未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)的目的旨于明確cFLIP在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)情況，并探討其表達(dá)與腫

3、瘤臨床病理參數(shù)、Fas蛋白表達(dá)情況的相關(guān)性。 方法：運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色方法檢測了58例頭頸部鱗狀細(xì)胞癌組織及30例形態(tài)學(xué)正常的、腫瘤周圍粘膜組織中cFLIP、Fas蛋白表達(dá)情況；運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測了30例癌組織及正常粘膜組織中cFLIP兩種蛋白亞型的mRNA表達(dá)水平；另外，應(yīng)用Western blot方法進(jìn)一步明確了cFLIP兩種蛋白亞型在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌組織及正常粘膜組織中的表達(dá)情況。

4、結(jié)果：1.cFLIP在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)明顯高于在正常粘膜：腫瘤組織中的陽性表達(dá)率為94.8％(55/58)，然而僅有15.0％(3/20)的正常粘膜呈現(xiàn)出輕微的cFLIP陽性反應(yīng)，并且兩者染色積分間的差異具有顯著性(P＜0.01)。 2.雖然在mRNA水平，cFLIP的兩種蛋白亞型：cFLIPL mRNA、cFLIPsmRNA在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌組織中均有表達(dá)，并且兩者的表達(dá)水平均高于其在正常粘膜中的表達(dá)(P＜0.01

5、)，但是利用Western blot方法僅檢測到cFLIPL蛋白的表達(dá)。 3.由于cFLIPLmRNA和cFLIP蛋白表達(dá)水平之間存在明顯的相關(guān)性、Western blot方法僅檢測到eFLIPL蛋白的表達(dá)，因此，可以認(rèn)為cFLIPL是cFLIP蛋白在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中的主要表達(dá)亞型。 4.cFLIP蛋白的表達(dá)水平與患者的年齡、性別、腫瘤原發(fā)部位和組織學(xué)分級(jí)之間無相關(guān)性，但是與腫瘤TNM分期(P＜0.01)以及有無淋巴結(jié)

6、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P=0.01)。 5.雖然，所有的正常粘膜組織和89.7％(52/58)腫瘤組織均不同程度的表達(dá)Fas蛋白，但是，F(xiàn)as蛋白染色積分在兩組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并且，F(xiàn)as蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤原發(fā)部位、組織學(xué)分級(jí)、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等臨床病理學(xué)參數(shù)均無相關(guān)性。雖然，所有Fas蛋白陽性表達(dá)的腫瘤組織均不同程度的表達(dá)cFLIP蛋白，但是，兩者的染色積分無任何相關(guān)性(P＞0.05)。

7、 結(jié)論：cFLIPL，蛋白高表達(dá)在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中是常見現(xiàn)象，并且cFLIPL蛋白的表達(dá)情況與腫瘤。TNM分期以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。由此可見，高表達(dá)的cFLIPL蛋白可以通過抑制Fas或其它的死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡從而在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。 第二部分：Luteolin誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞凋亡的途徑以及cFLIP的作用 目的：木犀草素(Luteolin)是一種很具有代表性的天然黃酮

8、化合物，具有多種生物學(xué)功能。近年來，其抗癌活性引起人們的關(guān)注。Luteolin可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但是，關(guān)于其對(duì)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(Head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)細(xì)胞的作用尚未見報(bào)道，并且其抗癌機(jī)制也有待于進(jìn)一步研究。雖然有研究表明Luteolin可以通過增加Caspase-8的活性、上調(diào)死亡受體表達(dá)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但是，未見有關(guān)死亡受體信號(hào)通路阻斷劑cFLI

9、P在Luteolin誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中作用的研究報(bào)道。本課題第一部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明cFLIPL在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，并且與腫瘤的臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)。并且，有研究表明：可能正是由于缺少了Caspase-8的活化而造成Hep-2細(xì)胞系對(duì)順鉑等化療藥物的不敏感。因此，我們擬研究Luteolin是否可以抑制頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系--Hep-2細(xì)胞的增殖活性、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及可能途徑以及cFLIP的作用。 方法：

10、Luteolin作用于Hep-2細(xì)胞不同時(shí)間階段后用MTT法測定Luteolin對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖活性的抑制作用；利用流式細(xì)胞儀檢測Luteolin對(duì)Hep-2細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響；以形態(tài)學(xué)、細(xì)胞凋亡標(biāo)記物檢測確定Luteolin是否可以誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞凋亡；利用流式細(xì)胞儀檢測Caspase家族活性變化；利用Western blot方法從蛋白水平研究Luteolin對(duì)Hep-2細(xì)胞cFLIP、Fas表達(dá)的影響；應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從

11、分子水平探討Luteolin對(duì)Hep-2細(xì)胞cFLIP、Fas蛋白表達(dá)影響的機(jī)制，并探討cFLIP在Luteolin誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的可能作用。 結(jié)果：1.Luteolin能有效抑制體外培養(yǎng)的Hep-2細(xì)胞的增殖活性，并且具有濃度和時(shí)間依賴性，藥物作用24h的半數(shù)抑制濃度(IC50)為52.69μmol/L。 2.Luteolin不僅可以誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯，細(xì)胞主要被阻滯于G1期；并且，這種細(xì)胞周期阻滯效應(yīng)

12、存在劑量依賴性。 3.Annexin-V/PI雙染法的結(jié)果表明Luteolin可以誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且隨作用時(shí)間延長、細(xì)胞凋亡率增加。而DAPI染色法的結(jié)果進(jìn)一步從形態(tài)學(xué)上證實(shí)Luteolin不僅可以誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞發(fā)生凋亡，而且細(xì)胞凋亡率隨藥物濃度增大而增加。 4.在Luteolin誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞發(fā)生凋亡的過程中Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9均被激活，三者的活性均隨著作用時(shí)

13、間延長而增加，但是，藥物作用1 2小時(shí)后以Caspase-8的活性增加最為突出并占居主導(dǎo)地位。 5.Luteolin可以降低Hep-2細(xì)胞內(nèi)cFLIPL蛋白的表達(dá)，并且與Caspases活化、Annexin-V/PI雙染法檢測到細(xì)胞凋亡的時(shí)間相吻合。隨著Luteolin作用時(shí)間延長cFLIP蛋白和mRNA的表達(dá)水平均下降，而Fas蛋白及其mRNA的表達(dá)水平均升高。 結(jié)論Luteolin作為一種很具有代表性的天然黃酮化合物

14、，不僅可以抑制體外培養(yǎng)的Hep-2細(xì)胞的增殖活性、引起細(xì)胞周期阻滯，并可誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞發(fā)生凋亡；Caspase-8和Caspase-9引導(dǎo)的信號(hào)通路均參與了Luteolin誘導(dǎo)的Hep-2細(xì)胞凋亡；而Luteolin可以通過降低cFLIP的mRNA和蛋白表達(dá)、上調(diào)Fas的mRNA和蛋白表達(dá)，從而活化Fas介導(dǎo)的信號(hào)通路在這一凋亡過程中發(fā)揮著重要作用。總之，Luteolin作為一種新型抗癌藥物有望用于包括頭頸部鱗狀細(xì)胞癌在內(nèi)的多種腫瘤