RhoC對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌Hep2細(xì)胞的影響.pdf

1、目的:
　　通過(guò)外源基因?qū)爰夹g(shù)抑制和增強(qiáng)喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞-Hep2中RhoC(Ras homology C,Ras同源類似物C)表達(dá),觀察腫瘤細(xì)胞凋亡、運(yùn)動(dòng)、形態(tài)學(xué)變化及腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物ALDH1A1(Aldehyde dehydrogenase1 family, member A1乙醛脫氫酶1A1)表達(dá)的變化,研究RhoC對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌生物學(xué)行為及腫瘤起始細(xì)胞群-腫瘤干細(xì)胞的影響,為以RhoC為治療靶點(diǎn)控制喉鱗癌的轉(zhuǎn)移提供實(shí)驗(yàn)

2、支持。
　　方法:
　　(1)通過(guò)分子生物學(xué)方法設(shè)計(jì)合成干擾RhoC表達(dá)可轉(zhuǎn)錄形成RhoC-shRNA(RhoC-short hairpin ribonucleic acid,RhoC短發(fā)卡核糖核酸)從而抑制 RhoC表達(dá)的 RhoC-shRNA基因重組質(zhì)粒GW-shRNA( RhoC-shRNA基因真核表達(dá)質(zhì)粒載體為pENTR?/U6-EGFP)和增強(qiáng)RhoC表達(dá)的RhoC G14V基因重組質(zhì)粒13GS03( RhoC G

3、14V基因真核表達(dá)質(zhì)粒載體為pcDNA3.1-EGFP)。(2)運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系-Hep2細(xì)胞中,并通過(guò)轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化,獲得最佳細(xì)胞轉(zhuǎn)染率。(3) QPCR(Real-time Quantitative polymerasechainreaction Detecting System,實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng))技術(shù)檢測(cè)影響 RhoC表達(dá)后 Hep2腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物-ALDH1A1的mRNA(mes

4、senger ribonucleic acid,信使RNA)表達(dá)。(4)TUNEL法檢測(cè)影響RhoC表達(dá)后Hep2細(xì)胞凋亡情況的變化。(5)熒光染色細(xì)胞骨架觀察影響RhoC表達(dá)后,Hep2細(xì)胞的形態(tài)變化。(6)劃痕實(shí)驗(yàn)觀察影響RhoC表達(dá)后Hep2細(xì)胞的的運(yùn)動(dòng)能力的變化。
　　結(jié)果:
　　(1)通過(guò)將兩種重組質(zhì)粒進(jìn)行基因測(cè)序及采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293T腎上皮細(xì)胞系,證實(shí)干擾RhoC表達(dá)的重組質(zhì)粒-GW-shRNA和增強(qiáng)RhoC

5、表達(dá)的重組質(zhì)粒-13GS03構(gòu)建成功。
　　(2)24孔板培養(yǎng)條件下,抑制 RhoC表達(dá)的重組質(zhì)粒GW-shRNA和增強(qiáng)RhoC表達(dá)的重組質(zhì)粒13GS03與脂質(zhì)體以1.2μg質(zhì)粒與4.2μl脂質(zhì)體混合形成的轉(zhuǎn)染復(fù)合物,Hep2喉鱗癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染率最高。
　　(3)抑制Hep2細(xì)胞RhoC表達(dá)后:腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物ALDH1A1表達(dá)顯著降低;凋亡增強(qiáng);細(xì)胞形態(tài)改變明顯,胞體較大,形狀近似多邊形。
　　(4)增強(qiáng)Hep2細(xì)胞Rh

6、oC表達(dá)后:腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物 ALDH1A1及腫瘤細(xì)胞凋亡較未處理Hep2細(xì)胞變化不顯著;細(xì)胞形態(tài)變化明顯,細(xì)胞近似梭形,類似間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài),提示細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)。
　　(5)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力結(jié)果顯示抑制RhoC表達(dá)使喉鱗癌Hep2腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力減低;增強(qiáng)RhoC表達(dá)后Hep2腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)。
　　結(jié)論:
　　1、成功構(gòu)建抑制RhoC表達(dá)重組質(zhì)粒GW-shRNA和增強(qiáng)RhoC表達(dá)重組質(zhì)粒13GS03,為

7、后續(xù)研究RhoC在喉鱗癌Hep2細(xì)胞中的功能奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　2、通過(guò)QPCR技術(shù)檢測(cè)增強(qiáng)RhoC表達(dá)后喉鱗狀細(xì)胞癌Hep2腫瘤細(xì)胞群中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物ALDH1A1與空白對(duì)照組相比無(wú)顯著變化,但抑制RhoC表達(dá)后ALDH1A1顯著降低,間接說(shuō)明了RhoC參與喉鱗癌腫瘤干細(xì)胞的形成,在轉(zhuǎn)移灶起始發(fā)生中具有一定的作用。
　　3、通過(guò)改變Hep2細(xì)胞中RhoC表達(dá),觀察腫瘤細(xì)胞的凋亡情況,結(jié)果顯示增強(qiáng)RhoC表達(dá)后細(xì)胞腫瘤細(xì)

8、胞凋亡現(xiàn)象不明顯,與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化,抑制RhoC表達(dá)腫瘤細(xì)胞凋亡增強(qiáng),說(shuō)明RhoC具有抑制喉鱗癌腫瘤細(xì)胞凋亡的作用,提高了腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移擴(kuò)散中對(duì)周圍陌生環(huán)境的適應(yīng)能力,使具有活性的腫瘤細(xì)胞能夠順利到達(dá)轉(zhuǎn)移瘤發(fā)生部位。
　　4、通過(guò)改變RhoC表達(dá)觀察Hep2細(xì)胞形態(tài)及運(yùn)動(dòng)能力的變化,結(jié)果顯示,增強(qiáng)RhoC表達(dá)后喉鱗癌腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng),抑制RhoC表達(dá)后腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力減弱,說(shuō)明RhoC對(duì)喉鱗癌腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用