體外培養(yǎng)的小鼠骨髓源性未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)小鼠同種異體移植心存活時(shí)間影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、20世紀(jì)以來(lái)，隨著器官移植技術(shù)，移植免疫基礎(chǔ)以及各種免疫抑制劑的研究進(jìn)展，心臟移植已成為治療終末期心臟病的有效手段。但是，由于急慢性排斥反應(yīng)造成的移植心臟功能障礙仍是影響療效的主要原因。而且，盡管現(xiàn)行的免疫抑制劑能在一定程度上控制排斥反應(yīng)，但這些免疫抑制劑幾乎無(wú)一例外的對(duì)受體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生非特異性的廣泛抑制，由此引起的感染，繼發(fā)腫瘤以及終身帶藥的巨額費(fèi)用嚴(yán)重影響著移植病人的生存質(zhì)量。因此，誘導(dǎo)供體特異性的免疫耐受被認(rèn)為是最終克服免疫排斥，

2、提高受者生存質(zhì)量的有效途徑。 排斥反應(yīng)的實(shí)質(zhì)是機(jī)體對(duì)異體抗原的免疫應(yīng)答反應(yīng)，這是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，涉及多種免疫細(xì)胞和免疫分子的相互作用。樹(shù)突狀細(xì)胞(dendriticcell，DC)是一種最為重要的專職抗原提呈細(xì)胞(antigenpresentingcell，APC)，是唯一能夠激活初始T細(xì)胞的APC。隨著對(duì)其在免疫反應(yīng)中作用機(jī)制的闡明，人們發(fā)現(xiàn)DC處于抗原提呈過(guò)程的中心環(huán)節(jié)，在移植免疫中起雙向作用。一方面，DC向受體T細(xì)胞提

3、呈供體抗原并提供活化信號(hào)，啟動(dòng)排斥反應(yīng)的發(fā)生，另一方面，某些DC具有免疫調(diào)節(jié)作用，在誘導(dǎo)和維持自體和外來(lái)抗原的免疫耐受中發(fā)揮重要作用。因此，利用DC的免疫調(diào)節(jié)作用誘導(dǎo)供體特異性的免疫耐受已成為當(dāng)前移植領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。 最近，有研究表明DC的功能與其細(xì)胞成熟狀態(tài)有關(guān)，成熟DC啟動(dòng)免疫反應(yīng)，而未成熟DC傾向誘導(dǎo)免疫耐受。本研究在低濃度粒巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的條件下體外培養(yǎng)擴(kuò)增小鼠骨髓源性未成熟DC，對(duì)其細(xì)胞形態(tài)、

4、表型及體外生物學(xué)特性進(jìn)行了觀察和檢測(cè)，并觀察將其通過(guò)不同的途徑、不同的方式輸入受體對(duì)小鼠同種異體移植心臟存活時(shí)間的影響，并初步探討其發(fā)生機(jī)制。本研究分為以下四部分： 第一部分應(yīng)用cuff技術(shù)建立小鼠頸部異位心臟移植模型 本部分我們運(yùn)用cuff技術(shù)建立了簡(jiǎn)單易行、穩(wěn)定可靠的小鼠頸部異位心臟移植模型并對(duì)其進(jìn)行觀察，為進(jìn)一步進(jìn)行移植免疫學(xué)研究作基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)分為同種異體移植組(n=15)和同系移植組(n=10)，同種異體移植采用雜

5、交昆明小鼠，同系移植在近交系BALB/c小鼠間進(jìn)行，共進(jìn)行正式移植手術(shù)25次。用硬膜外麻醉導(dǎo)管自制血管套管用于手術(shù)，動(dòng)脈端套管外徑0.6mm，內(nèi)徑0.4mm。手術(shù)在10倍手術(shù)顯微鏡下單人操作完成，采用供受體交替手術(shù)的方式縮短供心缺血時(shí)間，先準(zhǔn)備受體的動(dòng)脈、靜脈套管，然后切取供心，運(yùn)用cuff技術(shù)將受體頸總動(dòng)脈和頸外靜脈相應(yīng)與供心的主動(dòng)脈和肺動(dòng)脈吻合。結(jié)果顯示：25次正式手術(shù)，術(shù)后復(fù)跳率為100％，2例于術(shù)后第1天死亡，3天存活率為92％

6、，供心缺血時(shí)間均少于30分鐘。同種異體移植心存活時(shí)間平均為8天左右，病理檢查可見(jiàn)典型的排斥反應(yīng)征象，同系移植心可長(zhǎng)期存活，病理檢查未見(jiàn)明顯心肌損害。 第二部分低劑量GM-CSF培養(yǎng)小鼠骨髓源性未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究本部分建立了小鼠骨髓源性未成熟DC的培養(yǎng)方法，并初步觀察其生物學(xué)特性。無(wú)菌條件下分離小鼠的骨髓細(xì)胞，用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞后，用RMPI1640全培養(yǎng)液按2×106/ml的密度進(jìn)行培養(yǎng)，按加入細(xì)胞因子GM-CSF

7、的劑量分為常規(guī)劑量組(200U/ml)和低劑量組(50U/ml)，每3天換液1次，培養(yǎng)時(shí)間為12天，并加入脂多糖(LPS)觀察其對(duì)各組DC的促成熟作用。光鏡下對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞鑒定并檢測(cè)細(xì)胞表型，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)檢測(cè)其在體外刺激同種異體T細(xì)胞增殖的能力，并比較不同劑量GM-CSF下培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)IL-10和TGF-βmRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：常規(guī)劑量GM-CSF培養(yǎng)出的DC為成熟DC和未成熟DC的混合體，

8、經(jīng)LPS刺激后可迅速分化成熟，表型為CD11c+，CD25±，CD80+，CD86+，MHCⅡhi，在體外可強(qiáng)烈刺激同種異體T細(xì)胞分化增殖；而低劑量GM-CSF培養(yǎng)出的DC為較單純的未成熟DC，表型為CD11c+，CD25-，CD80-，CD86-，MHCⅡlow，加入LPS刺激后細(xì)胞表型無(wú)明顯變化，MLR提示不能有效刺激活化同種異體T細(xì)胞增殖，其IL-10mRNA表達(dá)水平明顯高于其他細(xì)胞，TGF-βmRNA在幾組細(xì)胞中的表達(dá)無(wú)明顯差異

9、。 第三部分術(shù)前輸注體外培養(yǎng)的供體未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)移植心存活時(shí)間影響的實(shí)驗(yàn)研究 本部分觀察用低劑量GM-CSF培養(yǎng)的小鼠骨髓源性未成熟DC術(shù)前輸注對(duì)同種異體移植心存活時(shí)間的影響。36只C57小鼠隨機(jī)分為4組，每組9只，術(shù)前將用低劑量GM-CSF的方法培養(yǎng)BALB/c小鼠骨髓源性未成熟DC約1.0×106個(gè)分別經(jīng)尾靜脈(imDCiv組)和門靜脈(imDCpv組)輸注C57小鼠體內(nèi)，對(duì)照組分別經(jīng)尾靜脈(NSiv組)和門靜脈

10、(NSiv組)注入生理鹽水，7天后行BALB/c→C57同種異體心臟移植。移植后7天，每組隨機(jī)取3只小鼠處死，用半定量RT-PCR方法檢測(cè)各組小鼠脾細(xì)胞Th1型細(xì)胞因子(INF-γ和IL-12)和Th2型細(xì)胞因子(IL-4和IL-10)mRNA的表達(dá)水平，移植心做病理檢查觀察排斥反應(yīng)程度，剩余小鼠觀察移植心存活時(shí)間。應(yīng)用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行微嵌合現(xiàn)象的檢測(cè)，將雄性BALB/c小鼠骨髓源性未成熟DC分別經(jīng)尾靜脈和門靜脈輸注雌性C57小鼠體

11、內(nèi)，分別于輸注后7天，14天和21天用檢測(cè)H-YmRNA的方法觀察供體源性DC在受體體內(nèi)的存活情況。結(jié)果顯示：imDCiv組和imDCpv組移植心存活時(shí)間均顯著長(zhǎng)于相應(yīng)對(duì)照組(分別為14.3±1.9dvs6.3±1.2d和22.7±5.7dvs7.5±1.6dP＜0.01)，且imDCpv組的移植心存活時(shí)間又明顯長(zhǎng)于imDCiv組(P＜0.01)。移植后7天imDCiv組和imDCpv組小鼠脾細(xì)胞Th1型細(xì)胞因子mRNA表達(dá)較對(duì)照組低，

12、而Th2型細(xì)胞因子mRNA表達(dá)較對(duì)照組高；移植心病理切片顯示：imDCiv組和imDCpv組第7天時(shí)移植心出現(xiàn)輕度排斥反應(yīng)(Stanford1～2級(jí))，而對(duì)照組NSiv組和NSiv組移植心出現(xiàn)嚴(yán)重排斥反應(yīng)(Stanford3～4級(jí))。微嵌合檢測(cè)表明供體未成熟DC經(jīng)門靜脈輸入受體21天后仍可檢測(cè)到供體H-YmRNA，而經(jīng)尾靜脈輸入則在第14天已幾乎檢測(cè)不到供體H-YmRNA。 第四部分術(shù)前輸注負(fù)載供體抗原的受體未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)移

13、植心存活時(shí)間影響的實(shí)驗(yàn)研究 本部分利用負(fù)載供體抗原的受體未成熟DC干擾T細(xì)胞的抗原間接識(shí)別途徑，并觀察其對(duì)同種異體移植心存活時(shí)間的影響。分別用低劑量和常規(guī)劑量GM-CSF培養(yǎng)受體小鼠骨髓源性未成熟DC和成熟DC，并在培養(yǎng)過(guò)程中加入供體可溶性抗原共同孵育，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表型，觀察負(fù)載供體抗原對(duì)受體DC協(xié)同刺激分子表達(dá)的影響，并用混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)檢測(cè)負(fù)載供體抗原的受體DC對(duì)自身T細(xì)胞的刺激活化作用。將負(fù)載供體抗原的受體

14、未成熟DC約2.0×106個(gè)于術(shù)前7天輸注受體體內(nèi)，觀察其對(duì)同種異體移植心存活時(shí)間的影響。用再次MLR的方法檢測(cè)輸注負(fù)載供體抗原的受體未成熟DC7天后，受體小鼠脾細(xì)胞對(duì)自身抗原，供體抗原及無(wú)關(guān)抗原刺激的反應(yīng)增殖能力。結(jié)果顯示：在受體DC培養(yǎng)過(guò)程中加入供體可溶性抗原對(duì)DC的細(xì)胞表型無(wú)明顯影響，與供體抗原共同孵育的受體成熟DC可明顯刺激自體T細(xì)胞活化增殖，說(shuō)明可以通過(guò)共同孵育的方式使受體DC有效負(fù)載供體抗原。負(fù)載供體抗原的受體未成熟DC在體

15、外不能有效刺激自體T細(xì)胞活化增殖，將其于術(shù)前輸注受體體內(nèi)，移植心的存活時(shí)間由7.2±1.7d延長(zhǎng)至17.7±3.3d。再次MLR的結(jié)果表明，輸注負(fù)載供體抗原的受體未成熟DC7天后，受體小鼠脾細(xì)胞對(duì)供體抗原刺激呈低反應(yīng)狀態(tài)，而對(duì)無(wú)關(guān)抗原刺激反應(yīng)正常。 結(jié)論1.應(yīng)用cuff技術(shù)建立小鼠異位心臟移植模型，明顯降低了手術(shù)難度，具有手術(shù)創(chuàng)傷小，供心缺血時(shí)間短，成功率高的優(yōu)點(diǎn)，是一種簡(jiǎn)單實(shí)用的方法。 2.用低劑量GM-CSF可培養(yǎng)出

16、性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定的未成熟的小鼠骨髓源性DC，表現(xiàn)為低水平表達(dá)MHCⅡ分子，不表達(dá)協(xié)同刺激分子CD80和CD86，LPS不能刺激其分化成熟，在體外不能有效刺激同種異體T細(xì)胞增殖。其高水平表達(dá)IL-10mRNA提示可能高水平分泌IL-10，可能是其成熟障礙的原因。 3.術(shù)前輸注用低劑量GM-CSF培養(yǎng)出的供體未成熟骨髓源性DC，可明顯延長(zhǎng)移植心的存活時(shí)間，可能與誘導(dǎo)受體Th1/Th2免疫偏移有關(guān)。 4.經(jīng)門靜脈輸入供體未成熟DC