CCR7基因轉(zhuǎn)染小鼠未成熟樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)皮膚移植免疫耐受的研究.pdf

1、研究背景及研究目的
　　 本研究擬通過構(gòu)建含有小鼠CCR7的重組腺病毒,嘗試在imDCs上建立CCR7的表達(dá),使imDCs獲得原本mDCs才具有的高效遷移能力,避免imDCs在外周組織向成熟狀態(tài)的分化,有效地確保其誘導(dǎo)免疫耐受功能的發(fā)揮,為臨床上大面積深度燒傷患者早期創(chuàng)面覆蓋引起的免疫排斥提供新的解決方法和思路。
　　 研究方法
　　 1、小鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定
　　 小劑量rmGM-CSF和r

2、mIL-4聯(lián)合體外誘導(dǎo)培養(yǎng)BALB/c小鼠骨髓來源的imDCs,第5天收獲得到一定數(shù)量的imDCs,加入rmTNF-α刺激細(xì)胞成熟而獲得mDCs。通過光學(xué)顯微鏡及掃描電鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志分子的表達(dá)水平。
　　 2、CCR7基因轉(zhuǎn)染小鼠骨髓源未成熟樹突狀細(xì)胞及其功能鑒定
　　 采用梯度離心法將Ad空載體和Ad-ccr7腺病毒轉(zhuǎn)染入imDCs,通過光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡來觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的變

3、化,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面的相應(yīng)標(biāo)志物,從而來觀察Ad-ccr7腺病毒轉(zhuǎn)染對小鼠骨髓源imDCs的成熟狀態(tài)及形態(tài)的影響。采用Real-time PCR法、細(xì)胞免疫熒光法、Western Blot法檢測Ad-ccr7腺病毒轉(zhuǎn)染前后小鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞CCR7mRNA及蛋白水平的表達(dá)變化。通過體外趨化試驗和混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)比較觀察Ad-ccr7腺病毒轉(zhuǎn)染前后小鼠骨髓源DCs的體外遷移能力和體外刺激T淋巴細(xì)胞增殖能力。
　　 3、

4、CCR7基因轉(zhuǎn)染imDCs對小鼠異基因皮膚移植的影響
　　 在小鼠異基因皮膚移植實驗中,我們將供者源imDCs、供者源mDCs、供者源imDCs+Ad、供者源imDCs+Ad-ccr7和供者源imDCs+Ad-ccr7+IL-10通過腹腔注射入受體小鼠體內(nèi),觀察各組細(xì)胞對小鼠異基因移植皮片存活狀況的影響,并通過組織學(xué)檢查觀察移植皮片的結(jié)構(gòu)改變。
　　 實驗結(jié)果
　　 1、小鼠骨髓源DCs的培養(yǎng)及鑒定結(jié)果
　

5、　 體外培養(yǎng)的DCs經(jīng)光學(xué)顯微鏡及掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn):imDCs表面光滑,凹凸不平,毛刺狀突起較少,而mDEs表面伸出許多較長的樹枝樣突起,突起長短不一,形態(tài)各異。流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)在imDCs中CD11c、CD80、CD83、MHCⅡ的陽性率分別為24.7％、9.4％、20.5％和20.5％,而在mDCs中CD11c、CD80、CD83、MHCⅡ的陽性率分別為86.5％、88.4％、76.9％和92.4％。這表明體外培養(yǎng)的DCs符合其

6、典型形態(tài)學(xué)特征和表面標(biāo)志水平。
　　 2、CCR7基因轉(zhuǎn)染對小鼠骨髓源imDCs的影響
　　 2.1采用高速離心法將Ad-ccr7腺病毒轉(zhuǎn)染入小鼠骨髓源imDCs內(nèi),其感染效率在MOI達(dá)到100時約有70％左右。在掃描電鏡中可見imDCs轉(zhuǎn)染腺病毒空載體和Ad-ccr7后,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,表面粗糙,細(xì)胞表面的不規(guī)則膜性樹枝狀突起較未轉(zhuǎn)染imDCs增多,而IL-10組細(xì)胞膜表面不規(guī)則突起明顯減少,這說明IL-10可一定程度

7、地抑NimDCs的成熟。小鼠骨髓源imDCs經(jīng)腺病毒轉(zhuǎn)染2天后,流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)imDCs+Ad組細(xì)胞中CD11c、CD80、CD83、MHCⅡ的陽性率分別為40.0％、27.7％、28.5％和37.8％。imDCs+Ad-ccr7組細(xì)胞中CD11c、CD80、CD83、MHCⅡ的陽性率分別為37.8％、27.4％、21.3％和37.0％,而imDCs+Ad-ccr7+IL-10組細(xì)胞中CD11c、CD80、CD83、MHCⅡ的陽性率

8、分別為20.5％、15.5％、21.6％和32.9％。這表明轉(zhuǎn)染Ad空載體和Ad-ccr7腺病毒可促使imDCs表面標(biāo)志略微升高,即向成熟方向發(fā)展,但加入細(xì)胞因子IL-10可略微下調(diào)這些表面標(biāo)志的表達(dá),在一定程度上抑制imDCs的成熟。
　　 2.2 Real-time PCR結(jié)果顯示,imDCs中CCR7mRNA水平較低,mDCs中CCR7mRNA含量是imDCs的1.544倍。imDCs轉(zhuǎn)染Ad空載體后,其CCR7mRNA含

9、量是imDCs的1.115倍,imDCs轉(zhuǎn)染Ad-ccr7腺病毒后,其CCR7mRNA含量是imDCs的2.941倍,而IL-10組中CCR7mRNA含量為imDCs的1.556倍,接近正常mDCs含量。這也說明Ad-ccr7腺病毒轉(zhuǎn)染可以明顯增加未成熟樹突狀細(xì)胞CCR7mRNA水平的表達(dá),同時IL-10在一定程度上可以抑制轉(zhuǎn)染過程中imDCs的成熟。
　　 2.3細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示imDCs和imDCs+Ad組細(xì)胞不表達(dá)CC

10、R7,而mDCs細(xì)胞可表達(dá)CCR7。imDCs轉(zhuǎn)染Ad-ccr7腺病毒后CCR7的表達(dá)增加,說明CCR7基因有效轉(zhuǎn)入imDCs并表達(dá)蛋白。Western Blot結(jié)果通過Qulitity One軟件分析顯示:imDCs、imDCs+Ad、imDCs+Ad-ccr7、imDCs+Ad-ccr7+IL-10和mDCs中CCR7蛋白表達(dá)的相對含量分別為0.09、0.15、0.96、0.46和0.35。結(jié)果表明,imDCs和imDCs+Ad組中

11、CCR7在蛋白水平幾乎不表達(dá),而轉(zhuǎn)染Ad-ccr7腺病毒后imDCs的CCR7蛋白含量明顯上升,其蛋白相對含量可以高于正常mDCs的含量。加入IL-10可以抑制imDCs朝成熟方向轉(zhuǎn)化,但是其CCR7蛋白的表達(dá)含量仍可以達(dá)到mDCs的水平。
　　 2.4體外遷移實驗結(jié)果表明imDCs細(xì)胞的體外趨化遷移率均低于5％,而mDCs、imDCs+Ad-ccr7、imDCs+Ad-ccr7+IL-10組細(xì)胞在CCL19作用下體外趨化遷移率

12、均較imDCs組明顯上升。而CCL19+anti-CCR7mAb組,在CCL19對抗劑anti-CCR7mAb作用下遷移率均有下降,但仍高于各自的空白組。這表明能夠表達(dá)CCR7蛋白的轉(zhuǎn)染病毒后imDCs及mDCs可在其配體CCL19的作用下增強(qiáng)體外遷移能力,同時anti-CCR7mAb可以在體外部分的拮抗其配體CCL19的作用。
　　 2.5混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果表明,imDCs以1:5比率與同種異體未致敏T淋巴細(xì)胞混合后imDC

13、s組刺激T淋巴細(xì)胞增殖能力較弱,刺激指數(shù)為1.6±0.1,而mDCs組刺激T淋巴細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng),刺激指數(shù)為5.6±0.3。腺病毒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞刺激T細(xì)胞增殖的能力較imDCs組增強(qiáng)但是弱于mDCs組,刺激指數(shù)分別為3.4±0.2和3.1±0.2,但是加入IL10可以明顯降低刺激能力,刺激指數(shù)為1.8±0.1。表明腺病毒轉(zhuǎn)染可部分增強(qiáng)imDCs的刺激增殖能力,但還是弱于mDCs,IL-10可抑制其促增殖能力。
　　 3、CCR7

14、基因轉(zhuǎn)染imDCs對小鼠異基因移植皮片的影響
　　 3.1通過與對照組(NS)相比較,供者源imDCs、供者源imDCs+Ad-ccr7、供者源imDCs+Ad-ccr7+IL-10組皮膚移植物的MST均明顯延長,而供者源mDCs和imDCs+Ad組MST與對照組相比無顯著性差異,說明單純使用供者源mDCs對移植皮片的存活無明顯影響,但供者源未成熟DC的應(yīng)用可延長皮片的存活時間。同時,供者源imDCs+Ad-ccr7+IL-10

15、組MST較供者源imDCs組顯著延長,而供者源imDCs+Ad-ccr7組MST較供者源imDCs組差異不明顯,顯示供者源imDCs在轉(zhuǎn)染腺病毒Ad-ccr7后,其誘導(dǎo)免疫耐受的能力較轉(zhuǎn)染前提高,加入IL-10更能夠顯著提高皮片存活的時間。
　　 3.2組織切片活檢顯示皮膚組織結(jié)構(gòu)較清楚,纖維組織結(jié)構(gòu)排列有序,成纖維細(xì)胞多,真皮層內(nèi)血管腔豐富,結(jié)構(gòu)完整,大小不一,局部有炎性細(xì)胞浸潤。表明皮片生長情況良好,白細(xì)胞的趨化功能正常。<

16、br>　　 結(jié)論
　　 1、小鼠骨髓來源細(xì)胞在應(yīng)用低劑量rmGM-CSF和rmIL-4聯(lián)合刺激誘導(dǎo)后獲得具有典型形態(tài)特征的imDCs和mDCs。
　　 2、Ad-ccr7腺病毒成功轉(zhuǎn)染入小鼠骨髓源imDCs內(nèi)。轉(zhuǎn)染后小鼠imDCs在形態(tài)學(xué)及細(xì)胞表面標(biāo)志分子上可向成熟狀態(tài)分化,但I(xiàn)L-10可一定程度地抑制imDCs的成熟。
　　 3、Real-time PCR結(jié)果表明Ad-ccr7腺病毒轉(zhuǎn)染可以明顯增加未成熟樹突

17、狀細(xì)胞CCR7mRNA水平的表達(dá),同時IL-10在一定程度上可以抑制轉(zhuǎn)染過程中imDCs的成熟。
　　 4、細(xì)胞免疫熒光及Western Blot結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染Ad-ccr7腺病毒后imDCs的CCR7蛋白含量明顯上升。加入IL-10可以抑制imDCs朝成熟方向分化,但其CCR7蛋白的表達(dá)含量仍可以達(dá)到mDCs的水平。
　　 5、體外遷移實驗表明imDCs細(xì)胞的體外趨化遷移率均較低,而轉(zhuǎn)染Ad-ccr7腺病毒后imDCs

18、在CCL19作用下體外趨化遷移率均較imDCs組明顯上升。同時anti-CCR7mAb可以在體外部分的拮抗其配體CCL19的作用。
　　 6、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)實驗顯示imDCs組刺激T淋巴細(xì)胞增殖能力較弱,而mDCs組刺激T淋巴細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)。Ad-ccr7腺病毒轉(zhuǎn)染后其刺激T細(xì)胞增殖的能力較imDCs組增強(qiáng)但是弱于mDCs組,加入IL-10可以明顯降低刺激能力。
　　 7、小鼠異基因皮膚移植實驗表明,單純使用供者