小鼠骨髓源未成熟及成熟樹(shù)突狀細(xì)胞培養(yǎng)及其上清液中細(xì)胞因子水平變化的研究.pdf

1、目的:樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）不但是先天免疫、適應(yīng)性免疫的中心調(diào)控者，而且在免疫耐受中起關(guān)鍵作用。迄今為止，樹(shù)突狀細(xì)胞被認(rèn)為是最有效的抗原提呈細(xì)胞，根據(jù)其表型、部位不同，功能也千差萬(wàn)別。多發(fā)性硬化（multiple sclerosis,MS）是神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)的自身免疫性疾病，主流觀點(diǎn)認(rèn)為MS的發(fā)生與T細(xì)胞的異常活化密切有相關(guān)，其中包括Th1/Th2失衡及Treg/Th17失衡，而樹(shù)突狀細(xì)胞是其平衡的主要調(diào)控細(xì)胞

2、。近年來(lái)，對(duì)MS免疫機(jī)制及耐受誘導(dǎo)治療成為研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)利用改良son法體外培養(yǎng)未成熟DC及成熟DC細(xì)胞，分析比較兩種細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-23、IL-35的表達(dá)量，探討IL-23、IL-35在DC細(xì)胞的正性免疫應(yīng)答及免疫耐受機(jī)制中的意義，為MS的治療尋求新的方向。
　　方法:
　　1.離體分離培養(yǎng)未成熟及成熟樹(shù)突狀細(xì)胞
　　取清潔級(jí)C57BL/6雌鼠，拉頸處死，依次浸泡于碘伏、75％酒精、75%酒精5min、2mi

3、n、2min。無(wú)菌彎鑷及剪刀剝離干凈小鼠腿部肌肉，浸泡股骨于無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）之中2min，無(wú)菌紗布擦拭股骨表面，浸泡于含有青鏈霉素的 RPMI-1640培養(yǎng)液中。于股骨兩端及中央打孔，無(wú)菌RPMI-1640沖洗骨髓腔，200目細(xì)胞篩過(guò)濾、紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞、RPMI-1640清洗。使用含10%胎牛血清、10ng/ml白細(xì)胞介素4（interleukin-4，IL-4）、1

4、0ng/ml粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子（granulocytemacrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）的RPMI-1640懸浮骨髓液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，接種于六孔板。分別于48h、96h全量及半量換液，補(bǔ)充細(xì)胞因子，第5天收集懸浮細(xì)胞即為未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(immature dendritic cells，imDCs)；第6天補(bǔ)充細(xì)胞因子干擾素-γ（interferon-γ，IFN

5、-γ），第7天收集懸浮細(xì)胞即為成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(mature dendritic cells,mDCs)。
　　2.流式細(xì)胞儀分選純化樹(shù)突狀細(xì)胞
　　分別收集第5天及第7天懸浮細(xì)胞，離心，CD11c標(biāo)記，無(wú)菌條件下經(jīng)流式細(xì)胞儀分選，收集CD11c+細(xì)胞，即為未成熟及成熟樹(shù)突狀細(xì)胞。
　　3.細(xì)胞鑒定
　　3.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定
　　3.1.1 熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)
　　3.1.2 掃描電鏡觀察細(xì)胞

6、表面形態(tài)
　　3.1.3 透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)
　　3.2 流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)細(xì)胞表面CD11c、MHCII、CD80、CD86分子表達(dá)情況
　　分別于第5天及第7天收集六孔板中懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD11c、MHCⅡ、CD80、CD86的分子表達(dá)情況。
　　4.雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附方法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）檢測(cè)細(xì)胞上清白細(xì)胞介素23（

7、interleukin-23，IL-23）、白細(xì)胞介素35（interleukin-35，IL-35）含量。
　　5.統(tǒng)計(jì)分析
　　定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，兩獨(dú)立樣本采用t檢驗(yàn)，多組之間采用方差分析，以P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.細(xì)胞形態(tài)學(xué)
　　1.1 熒光倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)
　　隨著時(shí)間延長(zhǎng)，顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞數(shù)量增多，體積變大，48h可見(jiàn)較多細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，少量懸

8、浮，96h可見(jiàn)細(xì)胞表面有突起，形態(tài)不一，第5天可見(jiàn)較多細(xì)胞懸浮，聚集成團(tuán)，第7天可見(jiàn)大量細(xì)胞懸浮，表面突起較多，集落增多，符合mDCs形態(tài)。
　　1.2 掃描電鏡下細(xì)胞形態(tài)
　　imDCs表面突起短、細(xì)、少，DCs表面突起長(zhǎng)、粗、大，外形類似樹(shù)枝，表面皺褶較imDCs多。
　　1.3 透射電鏡下細(xì)胞形態(tài)
　　imDCs細(xì)胞核不規(guī)則，偏向一側(cè)，胞質(zhì)細(xì)胞器較少，可見(jiàn)較多溶酶體；mDCs細(xì)胞核也不規(guī)則，胞質(zhì)內(nèi)溶酶體減少

9、，高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體較多。
　　2.細(xì)胞表面分子表達(dá)情況
　　使用流式細(xì)胞儀分選懸浮細(xì)胞，imDCs表面CD11c單陽(yáng)性率可達(dá)82.922±0.637%，CD11c+MHCII+、CD11c+CD80+、CD11c+CD86+雙陽(yáng)性率可達(dá)46.075±5.742%、8.057±2.307%、5.943±0.308%，CD11c+MHCII+CD80+和CD11c+MHCII+CD86+三陽(yáng)性率分別為8.810±0.64

10、2%、5.747±0.255%；mDCs表面CD11c單陽(yáng)性率可達(dá)91.143±0.751%，CD11c+MHCII+、CD11c+CD80+、 CD11c+CD86+雙陽(yáng)性率可達(dá)68.040±2.527%、46.397±2.982%、47.330±0.430%， CD11c+MHCII+CD80+和CD11c+MHCII+CD86+三陽(yáng)性率分別為15.810±1.773%、10.290±0.393%，imDCs與mDCs表面CD11c

11、單陽(yáng)性率、CD11c+MHCII+雙陽(yáng)性率、CD11c+CD80+雙陽(yáng)性率、CD11c+CD86+雙陽(yáng)性率、CD11c+MHCII+CD80+三陽(yáng)性率以及CD11c+MHCII+CD86+的三陽(yáng)性率之間有差異，且P＜0.05。
　　3.IL-23、IL-35水平的變化
　　與imDCs相比，mDCs中IL-23水平上升，IL-35水平下降，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.采用IL-4聯(lián)合GM