小鼠骨髓源未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的分離培養(yǎng)、純化和鑒定.pdf

1、目的:樹(shù)突狀細(xì)胞（dendriticcell，DC）是迄今發(fā)現(xiàn)惟一能刺激初始T細(xì)胞活化增殖的抗原遞呈細(xì)胞(antigenpresentingcell，APC)，也是體內(nèi)最主要的抗原遞呈細(xì)胞。既往認(rèn)為DC是特異性免疫應(yīng)答的啟動(dòng)者，但近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)DC在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮免疫應(yīng)答和免疫耐受的雙重作用。根據(jù)成熟程度，將DC分為未成熟DC(immatureDC，imDC)和成熟DC(matureDC，mDC)。mDC可以激活T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，

2、而imDC不能活化T淋巴細(xì)胞，但具有較強(qiáng)的抗原攝取及處理能力。最近的研究表明imDC可誘導(dǎo)免疫耐受，其機(jī)制有清除T細(xì)胞、誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫無(wú)能和誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生。基于imDC的特性，近年來(lái)將imDC用于T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病的研究越來(lái)越得到重視。因此，能夠準(zhǔn)確、高效的分離培養(yǎng)出imDC并對(duì)其進(jìn)行鑒定是運(yùn)用imDC開(kāi)展下游實(shí)驗(yàn)的前提與基礎(chǔ)。
　　 本研究旨在用rmGM-CSF、rmIL-4體外誘生小鼠骨髓源未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞，

3、并運(yùn)用免疫磁珠分離的方法純化所獲得的imDC，并從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表面分子的表達(dá)及對(duì)同種異基因T細(xì)胞的刺激增值能力三個(gè)方面對(duì)imDC進(jìn)行鑒定，對(duì)小鼠骨髓源未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)、純化和鑒定方法進(jìn)行探討和改良。
　　 方法:
　　 1小鼠骨髓源性未成熟DC的體外誘導(dǎo)及培養(yǎng)
　　 用拉頸法處死C57/B6小鼠，用75％乙醇與碘伏消毒后，無(wú)菌條件下取出下肢骨并去除周圍組織，在長(zhǎng)骨兩端打孔使骨髓腔聯(lián)通并暴露骨髓，用適

4、量RPMI-1640培養(yǎng)液沖出骨髓，使用200目濾網(wǎng)過(guò)濾雜質(zhì)并收集細(xì)胞后加入紅細(xì)胞裂解液。裂解紅細(xì)胞完畢后用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞，然后用細(xì)胞培養(yǎng)液(含10％胎牛血清、RPMI-1640、rmGM-CSF(10ng/ml)、rmIL-4(10ng/ml))調(diào)整細(xì)胞濃度到106/ml。6孔培養(yǎng)板中每孔加入4ml上述液體，將培養(yǎng)板放入37℃、含5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于第48小時(shí)更換培養(yǎng)液，于第96小時(shí)補(bǔ)充培養(yǎng)液，至第5天收集所

5、有懸浮細(xì)胞，用所得細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
　　 2分離純化imDC
　　 計(jì)數(shù)后將imDC重懸于緩沖液中并加入CD11c免疫磁珠，于4℃冰箱內(nèi)孵育15分鐘后重懸。利用磁珠分選器分選，將磁珠標(biāo)記的細(xì)胞懸液置入分選柱中，收集流出物，此為未標(biāo)記的陰性細(xì)胞。然后收集分選柱中的CD11c+細(xì)胞，此即為純化后的imDC。
　　 3小鼠骨髓源未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的鑒定
　　 3.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
　　 在倒置熒光顯微

6、鏡、掃描電鏡、透射電鏡下對(duì)imDC進(jìn)行觀察。
　　 3.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面分子
　　 將培養(yǎng)板中的懸浮細(xì)胞收集至離心管中，做流式細(xì)胞檢測(cè)前處理并加入抗體孵育。檢測(cè)imDC表面MHC-Ⅱ、CD11c、CD80、CD86分子的表達(dá)情況。
　　 3.3采用細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑法（CCK-8法）檢測(cè)imDC對(duì)同種異基因T細(xì)胞刺激增殖能力
　　 3.3.1取BALB/c小鼠脾臟中的T細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞，并取部分細(xì)胞

7、做分選前流式檢驗(yàn)。
　　 3.3.2取C57/B6小鼠骨髓中的imDC作為刺激細(xì)胞，方法同前。
　　 3.3.3用免疫磁珠法分離并純化小鼠脾臟T細(xì)胞并用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)純化后的細(xì)胞純度。
　　 3.3.4imDC與T細(xì)胞的單向混合淋巴反應(yīng)(one-waymixedlymphocytereaction，MLR):設(shè)定imDC∶T細(xì)胞比例為1∶5、1∶10、1∶20、1∶40，在96孔板中接種細(xì)胞并連續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)，

8、于培養(yǎng)結(jié)束前4小時(shí)加入CCK-8，在加入CCK-8后的第2、3、4小時(shí)分別使用酶聯(lián)檢測(cè)儀檢測(cè)一次并記錄吸光度值。
　　 結(jié)果:
　　 1未成熟DC生長(zhǎng)情況
　　 小鼠骨髓源細(xì)胞經(jīng)rmGM-CSF、rmIL-4誘導(dǎo)培養(yǎng)48小時(shí)后可見(jiàn)大部分細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)大小不等。于培養(yǎng)72小時(shí)后懸浮細(xì)胞較前增多，并出現(xiàn)幾個(gè)細(xì)胞聚集成團(tuán)的現(xiàn)象。第5天時(shí)懸浮細(xì)胞的體積變大數(shù)量明顯增多，細(xì)胞的集落現(xiàn)象也比以前更明顯，細(xì)胞表面無(wú)典型

9、樹(shù)突樣突起，符合imDC形態(tài)。經(jīng)計(jì)數(shù)后平均每只小鼠可獲得2.2×106個(gè)imDC。
　　 2未成熟DC的電鏡下形態(tài)
　　 2.1掃描電鏡下觀察
　　 掃描電鏡下imDC呈類圓形，細(xì)胞外部結(jié)構(gòu)完整，表面皺著較多似云霧狀，有少量的突起，但突起的長(zhǎng)度短，較纖細(xì)，符合典型的imDC的形態(tài)。
　　 2.2透射電鏡下觀察
　　 imDC細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，表面突起少，細(xì)胞微絨毛短小，細(xì)胞核偏向一側(cè)且不規(guī)則，可以看到

10、吞飲泡及較多的溶酶體。線粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量中等。
　　 3流式細(xì)胞儀檢測(cè)imDC表面分子
　　 小鼠骨髓源未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞高表達(dá)CD11c，純度在90％以上。細(xì)胞表面分子CD80（25.03％±2.77％）、CD86（19.93％±4.31％）、MHC-Ⅱ（23.93％±4.17％），均呈低表達(dá)，符合imDC表面標(biāo)志物的特征。
　　 4imDC對(duì)同種異基因T細(xì)胞的刺激增殖能力
　　 經(jīng)免疫磁珠分選后

11、的BALB/c小鼠脾臟T細(xì)胞，F(xiàn)CM檢測(cè)其純度大于90％。不同比例與各小時(shí)組的imDC與T細(xì)胞MLR刺激指數(shù)均說(shuō)明imDC有刺激同種異基因T細(xì)胞增殖的能力(SI＞1)，但各組刺激能力均很低。在加入CCK-8后的第2小時(shí)和第3小時(shí)分別檢測(cè)各相鄰imDC∶T細(xì)胞比例的刺激指數(shù)，結(jié)果均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);第4小時(shí)刺激指數(shù)與imDC所占比例呈正比，相鄰各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1.本

12、實(shí)驗(yàn)利用rmGM-CSF、rmIL-4體外誘導(dǎo)培養(yǎng)小鼠骨髓源imDC，并利用免疫磁珠分離提純的方法提高了imDC的純度，此方法培養(yǎng)出來(lái)的imDC具有典型的未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的形態(tài)，純度較高。
　　 2.從細(xì)胞形態(tài)、相對(duì)特異的表面分子的表達(dá)情況、對(duì)同種異基因T淋巴細(xì)胞的刺激增殖能力三方面證明體外培養(yǎng)所得細(xì)胞為未成熟的DC。在進(jìn)行imDC與同種異型T細(xì)胞的單向混合淋巴反應(yīng)時(shí)，用CCK-8法代替了傳統(tǒng)的MTT法，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加穩(wěn)定、可