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文檔簡介
1、植物病毒侵入寄主,先在細胞內(nèi)大量復制,經(jīng)過胞內(nèi)、胞間的橫向運輸和維管束長距離徑向運輸,才能成功系統(tǒng)侵染寄主。這個過程涉及病毒自身特異性編碼的運動蛋白(movement protein, MP)。研究表明,草莓鑲脈病毒(Strawberry vein banding virus,SVBV)編碼的P1蛋白是一個運動蛋白,但是病毒進入寄主體內(nèi)如何進行胞內(nèi)、胞間和長距離運動機制尚不明確。本課題分析和鑒定了MP蛋白的功能域,并研究了SVBV MP
2、蛋白的胞內(nèi)運動機制,為進一步研究SVBV MP蛋白的功能奠定了基礎。
1. SVBV MP蛋白功能域的預測
利用軟件分析了SVBV MP蛋白的功能域,發(fā)現(xiàn)119 aa-233 aa為運動相關(guān)的關(guān)鍵區(qū)域,而30 aa-55 aa和283 aa-329aa是蛋白互作的關(guān)鍵區(qū)域。
2. SVBV MP蛋白運動相關(guān)功能域的鑒定
為了確定MP蛋白的功能域,構(gòu)建了3個缺失突變體pCV-MP?30-55-YFP
3、、pCV-MP?119-233-YFP、pCV-MP?283-329-YFP。
?。?)MP缺失突變體的亞細胞定位含pCV-MP-YFP、pCV-MP?30-55-YFP、pCV-MP?119-233-YFP、pCV-MP?283-329-YFP和pCV-YFP的農(nóng)桿菌浸潤本氏煙,發(fā)現(xiàn) MP及其突變體 MP?30-55和 MP?283-329均能夠定位在細胞壁上,而突變體MP?119-233定位在細胞質(zhì)和細胞核上。說明 MP蛋白
4、119 aa-233 aa區(qū)域是決定MP運動相關(guān)的功能域。
(2) MP缺失突變體的運動回補功能含 pPVX-?P25-GFP、pPVX-?P25-GFP+pBin438、pPVX-?P25-GFP+pBin-MP?30-55、pPVX-?P25-GFP+pBin-MP?119-233和 pPVX-?P25-GFP+pBin-MP?283-329的農(nóng)桿菌浸潤本氏煙,發(fā)現(xiàn)MP、MP?30-55和MP?283-329能夠互補運動缺
5、陷型PVX載體,綠色熒光能從單個細胞向外擴散至3-4個細胞乃至整個葉片。表明MP蛋白119 aa-233 aa是決定MP運動相關(guān)的功能域。
3. SVBV MP蛋白與P4蛋白互作相關(guān)功能域的鑒定
(1)酵母雙雜交驗證互作功能域質(zhì)粒 pGBK-MP?30-55+pGAD-P4、pGBK-P4+pGAD-MP?30-55、pGBK-MP?119-233+pGAD-P4、pGBK-P4+pGAD-MP?119-233、pG
6、BK-MP?283-329+pGAD-P4和pGBK-P4+pGAD-MP?283-329分別共轉(zhuǎn)化酵母,發(fā)現(xiàn)pGBK-P4+pGAD-MP?119-233共轉(zhuǎn)化的酵母細胞能夠在選擇培養(yǎng)基上生長。表明MP30 aa-55 aa和283 aa-329 aa是與P4蛋白互作的關(guān)鍵功能域。
(2)雙分子熒光互補驗證互作功能域含pCV-nYFP-MP?30-55+pCV-cYFP-P4、pCV-nYFP-P4+pCV-cYFP-MP?
7、30-55、pCV-nYFP-MP?119-233+pCV-cYFP-P4、pCV-nYFP-P4+pCV-cYFP-MP?119-233、 pCV-nYFP-MP?283-329+pCV-cYFP-P4和pCV-nYFP-P4+pCV-cYFP-MP?283-329的農(nóng)桿菌分別共浸潤本氏煙,發(fā)現(xiàn)浸潤pCV-nYFP-MP?119-233+pCV-cYFP-P4農(nóng)桿菌的本氏煙表皮細胞中出現(xiàn)黃色熒光,說明SVBV MP30 aa-55 a
8、a和283 aa-329 aa是與P4蛋白互作的關(guān)鍵功能域。
4. SVBV MP蛋白的胞內(nèi)定位
含質(zhì)粒pCV-MP-YFP的農(nóng)桿菌浸潤本氏煙,發(fā)現(xiàn)MP蛋白形成的點顆狀物存在于細胞壁和細胞質(zhì)中,而且MP形成的點顆狀物在細胞質(zhì)中能夠沿著某種軌跡移動,最終定位于胞間連絲(PD)。表明 MP蛋白形成的點顆狀物在細胞質(zhì)中沿著某種軌跡靶向PD。
5. SVBV MP蛋白與微管的共定位
含質(zhì)粒pCV-MP-Y
9、FP和pCV-MT-RFP的農(nóng)桿菌共浸潤本氏煙,發(fā)現(xiàn)MP蛋白能夠和微管(MT)共定位。用微管抑制劑處理本氏煙表皮細胞后,再浸潤含質(zhì)粒pCV-MP-YFP和pCV-MP-YFP+MT-RFP的農(nóng)桿菌,發(fā)現(xiàn)MP蛋白任然能夠和微管(MT)共定位,只是靶向胞間連絲(PD)的MP蛋白數(shù)量明顯減少。表明SVBV MP蛋白靶向PD與細胞骨架微管的結(jié)構(gòu)有關(guān),但是微管不是MP蛋白胞內(nèi)運輸?shù)奈ㄒ煌緩健?br> 6. SVBV MP蛋白與微絲的共定位
10、> 含質(zhì)粒 pCV-MP-YFP和 pCAM-ABD2-GFP的農(nóng)桿菌共浸潤本氏煙,發(fā)現(xiàn)MP蛋白能夠和微絲(ABD2)共定位,說明SVBV MP蛋白靶向PD與細胞骨架微絲有關(guān)。
7. SVBV MP蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的共定位
含質(zhì)粒pCV-MP-YFP和pCV-ER-RFP的農(nóng)桿菌浸潤本氏煙,發(fā)現(xiàn)MP蛋白能夠和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)共定位,說明SVBV MP蛋白靶向PD與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有關(guān)。
8. SVBV編碼蛋白間的互作
11、r> 質(zhì)粒 pGBK-P3+pGAD-P4和 pGBK-P4+pGAD-P3分別共轉(zhuǎn)化酵母,發(fā)現(xiàn)SVBV P3與P4蛋白互作。含pCV-nYFP-P2+pCV-cYFP-P3、pCV-nYFP-P3+pCV-cYFP-P2、 pCV-nYFP-P3+pCV-cYFP-P4和pCV-nYFP-P4+pCV-cYFP-P3的農(nóng)桿菌共浸潤本氏煙,發(fā)現(xiàn)P2和P3以及P3和P4能夠互作。說明SVBV包裹核酸形成的病毒粒子的CP蛋白(P4)能夠與
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