番茄斑萎病毒和番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒細(xì)胞病理學(xué)及其運(yùn)動(dòng)蛋白的研究.pdf

1、番茄斑萎病毒屬(Tospovirus)侵染植物，寄主范圍廣泛，危害嚴(yán)重，近年來在我國陸續(xù)有許多新種或新分離物報(bào)道。其中番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒(Tomatozonate spot virus，TZSV)是2008年報(bào)道的該屬新種，與該屬代表種番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）基因組結(jié)構(gòu)相似，但是同源性較低。為了研究大顆粒病毒的胞間運(yùn)動(dòng)機(jī)理，我們對(duì)兩種病毒的細(xì)胞病理學(xué)及胞間運(yùn)動(dòng)機(jī)理開展了研究。
　　

2、 通過透射電子顯微鏡觀察常溫固定包埋和高壓冷凍固定包埋兩種方法處理的TSWV、TZSV感病植物葉片發(fā)現(xiàn)，兩種病毒的形態(tài)及細(xì)胞病理變化大致相似，但也存在差異。與TSWV相比，TZSV對(duì)細(xì)胞器的影響更大。TZSV侵染的葉片在葉綠體處也能像TSWV一樣產(chǎn)生囊泡，部分葉綠體的囊泡幾乎占據(jù)整個(gè)葉綠體，片層結(jié)構(gòu)破壞更加嚴(yán)重。在線粒體中也能夠產(chǎn)生與葉綠體內(nèi)相似的囊泡結(jié)構(gòu)，這種現(xiàn)象在TSWV侵染的葉片內(nèi)難以觀察到，相比之下，TSWV侵染的葉片線粒體保

3、存的更加完好。該結(jié)果也可以在一定程度上說明為什么在田間狀態(tài)下，TZSV對(duì)作物造成的危害更加嚴(yán)重。
　　 為了研究TSWV、TZSV運(yùn)動(dòng)蛋白NSm的細(xì)胞定位。將兩種病毒的NSm基因融合GFP后構(gòu)建到植物雙元表達(dá)載體pCHF3中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)浸潤本氏煙葉片，同時(shí)將融合GFP的NSm基因利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)體系轉(zhuǎn)染昆蟲Tn細(xì)胞。在激光共聚焦顯微鏡下觀察NSm-GFP在煙草表皮細(xì)胞中和昆蟲Tn細(xì)胞中的定位情況。觀察發(fā)現(xiàn)與單

4、獨(dú)表達(dá)GFP在細(xì)胞壁周圍和細(xì)胞核處均勻分布不同，TSWV、TZSV NSm-GFP融合蛋白會(huì)在植物細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散，能夠在細(xì)胞壁邊緣定位，并且在胞間連絲處呈不連續(xù)的綠色熒光小點(diǎn)，偶爾成對(duì)出現(xiàn)在相鄰的兩個(gè)細(xì)胞之間。TSWV的GFP-NSm融合蛋白能夠在昆蟲Tn細(xì)胞表面誘導(dǎo)產(chǎn)生數(shù)量眾多的管狀結(jié)構(gòu)并向外延伸，長度遠(yuǎn)長于在胞間連絲處形成的NSm蛋白小管。TZSV的GFP-NSm融合蛋白也能在昆蟲Tn細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，但是不能產(chǎn)生管狀結(jié)構(gòu)，主要分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)

5、，成團(tuán)塊狀聚集;該蛋白也能在細(xì)胞核表面定位，呈網(wǎng)刺狀，圍繞著細(xì)胞核形成圓環(huán)形。
　　 為了進(jìn)一步直觀研究兩種病毒的運(yùn)動(dòng)蛋白在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)的確切定位分布情況，利用大腸桿菌系統(tǒng)pET系列載體表達(dá)了TSWV、TZSV的NSm基因，以Ni2+-NTA agarose親和柱分別純化了這兩個(gè)蛋白與His組氨酸的融合蛋白并制備了相應(yīng)的多克隆抗體。其中，TSWV NSm蛋白制備的多克隆抗血清進(jìn)行Westem blot結(jié)果顯示，抗血清對(duì)該蛋白具有