銅綠假單胞菌表面粘附及運(yùn)動(dòng)機(jī)制的研究.pdf

1、現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)中，抗生素治療是對(duì)致病菌介導(dǎo)的感染性疾病最有效的治療手段之一。但抗生素治療無法有效應(yīng)對(duì)耐藥菌介導(dǎo)的或細(xì)菌生物被膜(biofilm)介導(dǎo)的感染性疾病，所以研究如何應(yīng)對(duì)這類感染性疾病是有關(guān)全人類健康的重要科學(xué)問題。其中生物被膜造成多種院內(nèi)獲得性感染無法治愈的關(guān)鍵是生物被膜被自身分泌的胞外聚合物（extracellular polymeric substances）所包裹，從而極大地增強(qiáng)了其內(nèi)部細(xì)菌對(duì)外部環(huán)境張力的抗性，如:對(duì)宿主

2、免疫系統(tǒng)、抗生素、重金屬、表面活性劑等。在細(xì)菌生物被膜形成的過程中，細(xì)菌在表面上的初始粘附以及在表面上的適應(yīng)、擴(kuò)張是生物被膜形成、發(fā)展的必要條件，所以相關(guān)基礎(chǔ)研究對(duì)發(fā)展細(xì)菌生物被膜防治的新方法具有重大意義。由于缺乏有效的原位表征手段，目前此類基礎(chǔ)研究仍十分匱乏。另一方面，由于高分子材料制備的醫(yī)療器械在臨床上被廣泛使用，所以研究致病菌細(xì)菌在這類表面上的初始粘附以及后續(xù)的適應(yīng)、擴(kuò)張以及生物被膜形成等過程具有重要的臨床指導(dǎo)意義。針對(duì)以上所述的

3、研究現(xiàn)狀，通過建立新的表征手段，本論文以院內(nèi)獲得性感染的三大致病菌之一的銅綠假單胞菌為研究對(duì)象，系統(tǒng)地研究了其在多種高分子材料表面上的粘附以及擴(kuò)散、遷移的機(jī)制。
　　銅綠假單胞菌在多種高分子材料表面粘附機(jī)制的研究:
　　通過將微流控，顯微拍照，分子生物學(xué)等技術(shù)緊密結(jié)合，我們首先建立了銅綠假單胞菌在表面粘附行為以及粘附力表征的高通量實(shí)驗(yàn)方法。利用所建立的實(shí)驗(yàn)方法，我們?cè)趩渭?xì)菌的尺度下原位地表征了多種與細(xì)菌表面粘附相關(guān)基因的單突

4、變菌株在不同性質(zhì)材料表面的粘附行為并量化了其粘附力的大小以及胞外聚合物的粘度、剪切模量等流變性質(zhì)。我們發(fā)現(xiàn)單克隆銅綠假單胞菌株在表面上的粘附存在著巨大的表型差異，表現(xiàn)為:1）菌間表面粘附力大小的差異在三個(gè)數(shù)量級(jí)以上;2）表面粘附的細(xì)菌對(duì)流場(chǎng)剪切的響應(yīng)可分為三種亞型，其中包括可抵抗流場(chǎng)剪切的(stick-type)，或沿流場(chǎng)剪切方向滑動(dòng)的(slide-type)以及在流場(chǎng)剪切下脫附的(detach-type)三類;3）存在15％-25％比

5、例的細(xì)菌可抵抗高達(dá)2000 Pa強(qiáng)流場(chǎng)的剪切。我們進(jìn)一步的研究表明這類可抵抗強(qiáng)流場(chǎng)剪切的銅綠假單胞茵表型可在多種高分子材料表面上形成具有普遍意義，所以我們定義這類特殊的細(xì)菌表型為強(qiáng)剪切流場(chǎng)耐受型(SSP)。特別值得指出的是:我們發(fā)現(xiàn)由SSP表型所形成的生物被膜對(duì)妥布霉素具有更高的耐受性。通過對(duì)銅綠假單胞菌中粘附因子的單基因突變，我們發(fā)現(xiàn)外膜蛋白CdrA和胞外多糖Psl對(duì)SSP的形成起決定性作用。最后通過對(duì)這兩種胞外聚合物的粘度、剪切模量

6、等流變性質(zhì)的測(cè)量以及體外實(shí)驗(yàn)，我們最終發(fā)現(xiàn)SSP形成的分子機(jī)制是:CdrA交聯(lián)了Psl在細(xì)菌和基底間形成了凝膠狀的粘結(jié)復(fù)合體，這種凝膠狀的粘結(jié)復(fù)合體可產(chǎn)生高達(dá)50 N/mm2粘附強(qiáng)度。SSP表型的發(fā)現(xiàn)以及其形成分子機(jī)制的闡明對(duì)醫(yī)用抗菌高分子材料的研發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義。
　　銅綠假單胞菌在高分子刷表面上蹭型機(jī)制的研究:
　　為了探索高分子材料粘彈性（軟硬）對(duì)銅綠假單胞菌傳播、遷移能力的影響，我們制備了溫度響應(yīng)的聚異丙基丙烯酰

7、胺PNIPAM高分子刷表面，從而原位的實(shí)現(xiàn)了利用溫度控制材料表面的粘彈性。通過和高速顯微拍照、單細(xì)菌追蹤等技術(shù)相結(jié)合，我們發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞茵在可剪切變稀的軟表面上蹭型運(yùn)動(dòng)(twitchingmotility)時(shí)，細(xì)菌可調(diào)控其四型菌毛(TFP)產(chǎn)生可高頻次的彈射運(yùn)動(dòng)(slingshot)運(yùn)動(dòng)。進(jìn)一步的研究指出，高頻次的彈射運(yùn)動(dòng)可令細(xì)菌所接觸的高分子刷表面進(jìn)入剪切變稀的狀態(tài)，令表面的粘度顯著降低。從而極大地減小了細(xì)菌在表面進(jìn)行蹭型運(yùn)動(dòng)時(shí)所受的