CD133陽性造血祖細胞對結(jié)直腸癌細胞生物學(xué)特性的影響.pdf

1、研究背景和目的： 結(jié)直腸癌(colorectalcarcinoma，CRC)是我國常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，而轉(zhuǎn)移是患者的主要致死原因。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個多步驟、多階段的復(fù)雜過程，轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞經(jīng)歷了細胞骨架變化、黏附特性的改變、運動能力的增強及蛋白水解酶表達增加等一系列改變。 動物實驗最新的研究表明，造血祖細胞與腫瘤轉(zhuǎn)移有著密切聯(lián)系，KaplanRN等利用β半乳糖苷酶標記骨髓細胞移植的小鼠Lewis肺癌模型、小鼠B16黑

2、色素瘤模型和c-myc轉(zhuǎn)基因小鼠自發(fā)性淋巴瘤模型發(fā)現(xiàn)：VEGFR-1陽性造血祖細胞(vascularendothelialgrowthfactorreceptor-1hemopoieticprogenitorcells，VEGFR-1+HPC)首先在特定器官形成VEGFR-1+HPC細胞簇(VEGFR-1+HPCcellularclusters)，為瘤細胞準備了易于形成轉(zhuǎn)移的微環(huán)境，這些細胞簇形成部位與腫瘤轉(zhuǎn)移常見部位一致。研究表明，V

3、EGFR-1+HPC充當(dāng)了腫瘤轉(zhuǎn)移必不可少的細胞書簽(cellularbookmarking)或者說特使細胞(envoycells)。VEGFR-1+HPC并非以前發(fā)現(xiàn)的血管內(nèi)皮祖細胞(endothelialprogenitorcells，EPC)即VEGFR-2陽性造血祖細胞，腹腔注射VEGFR-2抗體，不能阻斷VEGFR-1+HPC細胞簇形成及瘤轉(zhuǎn)移灶形成，只能限制腫瘤轉(zhuǎn)移灶生長。同時利用VEGFR-1抗體阻斷或剔除VEGFR-1+

4、HPC，則能夠抑制預(yù)遷移器官造血祖細胞簇的形成與腫瘤轉(zhuǎn)移。但造血祖細胞在人體腫瘤的主要作用及機制仍不十分清楚，且目前尚未在人類腫瘤模型上得到證實，由于臍血來源廣泛，獲取較容易，成為骨髓及外周造血干祖細胞的極佳替代來源，我們選定CD133+造血祖細胞，在減少其誘導(dǎo)分化的同時，觀察其對低轉(zhuǎn)移人大腸癌細胞體內(nèi)外的增殖和侵襲作用。 CD133是一個目前公認的造血祖細胞表面抗原，在正常及異常造血和非造血組織中均有表達，隨著細胞的分化成熟其

5、表達減弱、消失。在正常造血組織中，如人胚胎、肝臟和骨髓、臍血、成人骨髓和外周血CD34+細胞中都可檢測到CD133mRNA，而在其他成熟血細胞均未檢測到其表達。同時隨著最新的研究表明，CD133mRNA在外周血中的表達里，實體惡性腫瘤轉(zhuǎn)移患者的表達水平明顯高于非轉(zhuǎn)移患者，且以骨轉(zhuǎn)移患者的CD133mRNA表達為著。但這一結(jié)果的作用機制主要是由于CD133+造血祖細胞或者是CD133+腫瘤干細胞的結(jié)果尚不清楚。 本研究重點探討CD

6、133+造血祖細胞對結(jié)直腸癌增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移的影響，闡明CD133+造血祖細胞在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的主要生物學(xué)功能，為揭示結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移機制及抗轉(zhuǎn)移治療奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.CD133+造血祖細胞的篩選、鑒定及培養(yǎng) 由南方醫(yī)院婦產(chǎn)科提供新鮮臍血標本20例，在臍血采集后6h內(nèi)，利用CD133+免疫磁珠，分離出CD133+造血祖細胞，并分別予流式細胞儀及免疫細胞染色分析和鑒定樣本量中CD133+細胞含量，同時在減少誘導(dǎo)C

7、D133+分化的同時，培養(yǎng)CD133+造血祖細胞。 2.CD133+造血祖細胞對結(jié)直腸癌細胞生物學(xué)特性的影響 將CD133+造血祖細胞與SW480共趨化培養(yǎng)，用MTT法檢測腫瘤細胞的增殖及黏附能力的影響，用Transwell小室法檢測腫瘤細胞的遷移能力的變化，用Westernblot了解VEGFR-1、MMP-2、E-Cadherin的表達情況。觀察CD133+造血祖細胞作用前后細胞增殖、體外侵襲變化。 3.應(yīng)用

8、整體可視化結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移動物模型觀察共移植效應(yīng) 利用穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)的結(jié)腸癌細胞株SW480/EGFP+；通過結(jié)腸癌尾靜脈注射的方法建立結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移模型，利用腫瘤細胞表達EGFP的特點，將CD133+細胞與SW480/EGFP+共培養(yǎng)通過尾靜脈注射的方法觀察腫瘤細胞成瘤能力及體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的變化，應(yīng)用組織病理學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)對結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移動物模型進行評價和鑒

9、定。 結(jié)果： 1、CD133+造血祖細胞的篩選、鑒定及培養(yǎng) 由南方醫(yī)院婦產(chǎn)科提供，臍血標本共20份(其中18份成功提取新鮮細胞，2份失敗)，50～80ml/份，枸櫞酸抗凝，經(jīng)產(chǎn)婦和家屬同意取自足月健康順產(chǎn)新生兒，新鮮臍血采集后6h內(nèi)，分離出CD133+造血祖細胞。從新鮮的臍血中得到的單個核細胞數(shù)平均為(1.48±0.19)×107/ml，經(jīng)CD133磁珠分離系統(tǒng)分離得CD133+富集細胞的平均數(shù)為(1.33±0.

10、01)×105/ml，新鮮臍血單個核細胞中的CD133+細胞所占比例為(0.8±0.01)％，經(jīng)流式細胞儀鑒定CD133+CD34+細胞純度達到80％以上。CD133+細胞培養(yǎng)一周后，免疫細胞化學(xué)染色CD133，顯微鏡下觀察CD133陽性細胞數(shù)>90％。 2、CD133+造血祖細胞對結(jié)直腸癌細胞生物學(xué)特性的影響 CD133+造血祖細胞能顯著促進SW480細胞的生長(n=60、Z=-6.106、P=0.000)，能促進腫瘤

11、細胞的形態(tài)學(xué)改變，即腫瘤細胞的核深染，異型明顯，細胞呈多角形或不規(guī)則形，能顯著促進SW480細胞的遷移能力；細胞黏附實驗表明，含有CD133+造血祖細胞的實驗組其腫瘤細胞的黏附能力明顯高于對照組(n=60、Z=-3.679，P=0.000)。利用丙酮沉淀法提取細胞總蛋白(即濃縮蛋白)檢測MMP-2、VEGFR-1及E-Cadherin蛋白表達情況發(fā)現(xiàn)實驗組中的3種蛋白表達水平均高于對照組。 3、利用整體可視化結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移裸鼠模型觀

12、察共移植效應(yīng) 轉(zhuǎn)染后的結(jié)腸癌細胞SW480/EGFP+穩(wěn)定、高效的表達綠色熒光蛋白，采用尾靜脈注射的方法建立結(jié)腸癌可視化轉(zhuǎn)移動物模型，注射2周后，實驗組可見腫瘤轉(zhuǎn)移，對照組未見有轉(zhuǎn)移情況，注射4周后，實驗組67％發(fā)生轉(zhuǎn)移，對照組僅有一只發(fā)生轉(zhuǎn)移，注射6周后，實驗組中成瘤轉(zhuǎn)移率為4/6，對照組中的成瘤轉(zhuǎn)移率為1/6。經(jīng)過生存分析的統(tǒng)計結(jié)果表明，實驗組的轉(zhuǎn)移率高于對照組(n=6，Breslow檢驗，P=0.045)。通過分子生物學(xué)技

13、術(shù)，發(fā)現(xiàn)實驗組中MMP-2、VEGFR-1蛋白高表達，而E-Cadherin的表達則逐漸減低。 結(jié)論： 1、CD133+造血祖細胞可顯著促進人結(jié)直腸癌細胞的增殖及侵襲能力，CD133+造血祖細胞與人結(jié)直腸癌細胞裸鼠共移植具有促轉(zhuǎn)移作用，初步證明，人造血祖細胞可能對人結(jié)直腸癌細胞轉(zhuǎn)移形成具有重要影響。 2、CD133+造血祖細胞可與結(jié)直腸癌細胞直接作用，能促進轉(zhuǎn)移相關(guān)基因和血管生成因子MMP-2、VEGFR-1蛋白

14、高表達，同時調(diào)節(jié)E-Cadherin的蛋白表達，初步表明：CD133+造血祖細胞的促轉(zhuǎn)移作用可能與轉(zhuǎn)移相關(guān)因子MMP-2、VEGFR-1及E-Cadherin的表達有關(guān)。 本研究的創(chuàng)新之處： 1、將人造血祖細胞與結(jié)直腸癌細胞株共趨化培養(yǎng)，直接在人癌實驗層次揭示了造血祖細胞對結(jié)直腸癌細胞的作用。 2、將人造血祖細胞與結(jié)直腸癌細胞株共趨化培養(yǎng)后進行人類腫瘤動物模型共移植實驗研究。初步證明，CD133+人造血祖細胞可顯