IGFBP7在結(jié)直腸癌細胞的生物學(xué)效應(yīng)研究.pdf

1、結(jié)直腸癌是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一.諸多類型腫瘤中,結(jié)直腸癌的分子機理研究開展比較早,研究得相對比較清楚.自Vogelstein提出經(jīng)典的結(jié)直腸癌的多步驟、多基因的發(fā)生發(fā)展模式以來,結(jié)直腸癌的分子病理學(xué)在不斷發(fā)展,一系列與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)的基因被相繼發(fā)現(xiàn).近二十年來,隨著我國居民生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變,結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)上升的趨勢,積極開展對結(jié)直腸癌相關(guān)分子的尋找,并進行功能研究,明確其在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的確切作

2、用及其相關(guān)分子機制,對尋找結(jié)直腸癌的診斷、治療、預(yù)后靶標有很重要的意義. 結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是個多步驟的過程,其中從正常粘膜-腺瘤-癌變途徑是最重要的發(fā)生模式,探索上述過程中的基因表達改變對于加深我們對結(jié)直腸癌機理的認識有著重要意義.我們實驗室于1999年原創(chuàng)性地運用抑制性差減雜交法建立了三個結(jié)直腸癌相關(guān)差減文庫:腺癌相對腺瘤(T-A)、腺癌相對正常粘膜(T-N)、腺瘤相對正常粘膜(A-N),從中篩選出一系列在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展

3、過程中差異表達的基因,并進行后續(xù)的深入研究. 胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7)是在F-N文庫中篩選頻率較高、在腺癌中高表達的一個基因.我們前期運用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法和免疫組化法檢測證實IGFBP7mRNA以及蛋白水平在結(jié)直腸癌組織中高表達,但在結(jié)直腸癌細胞系卻是低表達,在所檢測的SW480、SW620、HT29、RKO、SW1116、HCT8、COLO205、Caco2、CW2、Hce8693中,IGFBP7只在SW480與Ca

4、co2細胞系中表達陽性.這個矛盾現(xiàn)象也給這個基因在結(jié)直腸癌里的真正作用添加了神秘色彩.本課題旨在通過兩部分工作的研究:IGFBP7在結(jié)直腸癌細胞的生物學(xué)功能以及其引起的效應(yīng)分子改變,明確其在結(jié)直腸癌中的生物學(xué)效應(yīng). IGFBP7在結(jié)直腸癌細胞系的低表達現(xiàn)象給了我們一個思路:將IGFBP7cDNA轉(zhuǎn)染到不表達內(nèi)源性IGFBP7的結(jié)直腸癌細胞中會產(chǎn)生怎樣的變化?我們選用了具備不同遺傳學(xué)背景的兩株不表達內(nèi)源性IGFBP7的RKO,SW

5、620細胞作為我們的細胞模型.我們構(gòu)建了PcDNA3.1真核表達載體,將其轉(zhuǎn)染到RKO與SW620細胞,RT-PCR以及細胞分泌上清western blot證實了IGFBP7的表達.然后我們對其一系列生物學(xué)效應(yīng)進行了檢測分析.包括細胞生長實驗、軟瓊脂克隆形成實驗、凋亡相關(guān)檢測. 細胞計數(shù)試劑盒-8分析顯示:IGFBP7可以抑制結(jié)直腸癌細胞的生長.IGFBP7-RKO,IGFBP7-SW620的轉(zhuǎn)染株的生長速度要明顯慢于轉(zhuǎn)染空載體

6、對照組.我們還比較了同一病人來源卻具有不同IGFBP7表達譜的兩株細胞SW480(來自原發(fā)灶,IGFBP7陽性)與SW620(來自轉(zhuǎn)移灶,IGFBP7陰性)的生長速率.結(jié)果顯示:IGFBP7陽性的SW480細胞的生長速率要明顯慢于IGFBF7陰性SW620(p=0.0108). 軟瓊脂克隆形成實驗顯示:IGFBP7可以降低RKO與SW620的軟瓊脂克隆形成能力.細胞鋪板軟瓊脂孵育三周后,我們進行>100μm克隆計數(shù).IGFBP7

7、-RKO VS對照:平均12VS 59,p=0.0004;IGFBP7-SW620 VS對照:平均18 VS 55,p=0.0026.同時,我們也觀察到IGFBP7轉(zhuǎn)染株的克隆要比對照組小,這也證實了我們上述關(guān)于IGFBP7是抑制結(jié)直腸癌細胞生長的結(jié)果.我們注意到,RKO細胞IGFBP7轉(zhuǎn)染株與對照株的克隆大小差異更明顯,這可能與兩株細胞的基礎(chǔ)背景特點不同有關(guān).具體機理還有待深入研究. 碘化丙錠(propidium iodide

8、,PI)單染,PI/Annexin V雙染的流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染IGFBP7 48小時,細胞出現(xiàn)sub-G1峰,Annexin V陽性率增加,透射電鏡對細胞內(nèi)部形態(tài)的觀察顯示:轉(zhuǎn)染IGFBP7以后,細胞出現(xiàn)核皺縮、染色質(zhì)邊聚的趨勢,提示IGFBP7誘導(dǎo)細胞凋亡.免疫印跡顯示IGFBP7在RKO細胞中可以引起Caspase-3表達增高,提示Caspase-3相關(guān)途徑可能是IGFBP7在結(jié)直腸癌細胞中誘導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵途徑. 我們發(fā)現(xiàn)

9、的IGFBP7對結(jié)直腸癌細胞的生長抑制作用與其它實驗室報道的該蛋白對其它腫瘤細胞,包括乳腺癌細胞、前列腺癌細胞、肺癌細胞、宮頸癌細胞、骨肉瘤細胞等的生長抑制作用是相一致的.結(jié)合我們實驗室近期關(guān)于結(jié)直腸癌組織中IGFBP7的表達與預(yù)后生存分析的結(jié)果:IGFBP7表達越高,病人的預(yù)后越好(p=0.012),且IGFBP7是個獨立評價預(yù)后因子,我們認為:IGFBP7是結(jié)直腸癌的保護因子,扮演著腫瘤抑制基因的角色. 我們通過上述第一部

10、分的實驗明確了IGFBP7在結(jié)直腸癌中的抑癌的生物學(xué)功能.前期在進行IGFBP7在結(jié)直腸癌組織的研究時,我們意外地發(fā)現(xiàn)其表達水平與病人空腹血糖水平成正相關(guān),提示IGFBP7是個與2型糖尿病相關(guān)的分子.其它實驗室的研究也提示IGFBP7在前列腺癌、乳腺癌、肺癌中是個潛在的抑癌基因,同時近年來的研究也提示IGFBP7與胰島素抵抗、2型糖尿病相關(guān).迄今為止.IGFBP7在腫瘤和糖尿病的發(fā)生發(fā)展中具有重要生物學(xué)作用已經(jīng)明確,但IGFBP7的深入

11、分子機制一直未闡明.接下去我們的工作就是要探索IGFBP7上述生物學(xué)效應(yīng)的分子機制,更深入客觀地了解這個因子,為我們所觀察檢測到的IGFBP7相關(guān)生物學(xué)現(xiàn)象提供機制支持. 為了客觀深入地檢測IGFBP7引起的結(jié)直腸癌細胞的內(nèi)部變化,我們采用Affymetrix HGU133 plus 2.0全基因組芯片與雙向凝膠電泳(two dimensional electruphoresis,2-D)技術(shù)從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平觀察轉(zhuǎn)染IGFB

12、P7到RKO細胞后(IGFBP7轉(zhuǎn)染株作為實驗組,以空載體轉(zhuǎn)染株作為對照組)引起的效應(yīng)分子改變.為避免克隆間本身存在的差異,我們在每組中均挑取了三個克隆,組成三個配對組,每組用完全一樣的培養(yǎng)條件,以減少外界環(huán)境帶來的假陽性差異表達基因. Affymetrix芯片結(jié)果顯示,在三組中具有重復(fù)性交化趨勢的基因共有78個,我們對這些基因進行了Gone Ontology分析,發(fā)現(xiàn)了一系列非常有意思的現(xiàn)象.信號通路富集度分析顯示:MAPK(

13、Mitogen-Activated Protein Kinase)通路、胰島素/IGFl通路、TGF-β通路顯著富集,提示IGFBP7與相關(guān)通路關(guān)系密切.具體參與的基因是: MAPK通路:GADD45B,FOS,RASAI,FLNB,NR4AI.主要涉及到:ERKI/2,JNK和p38 MAP激酶通路. 胰島素/IGFI通路:IRSl,RASAl,FOS.其中RASAl與FOS屬MAPK通路部分. TGF.B通路

14、:CDKN2B,IDl,ID3,SMAD3. 用有向無環(huán)圖分析所篩基因的功能富集趨勢,結(jié)果顯示細胞骨架、actin相關(guān)基因顯著富集,提示通過對細胞骨架的重塑也許是IGFBP7發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)的重要機制之一.IGFBP7引起細胞骨架相關(guān)基因改變與我們觀察到的IGFBP7引起RKO細胞變狹長的形態(tài)改變相呼應(yīng),提示IGFBP7也許是通過對這些基因的影響進而引起細胞形態(tài)的改變. 在三個克隆里具有一致性變化的基因有16個:包括IG

15、FBP7,TAGLN,SPl40,FRMD4A,CALD,NAV3,SOX9-box 9STCl,AREG,ID1,IRS1,TACSTD,IERSL,CDKN2B,SYN1.這些基因已經(jīng)得到了熒光定量PCR的驗證. 本文又在另外一株結(jié)腸癌細胞株SW620中進行了這些基因的驗證以明確IGFBP7引起的這些差異表達基因是否具有在結(jié)直腸癌細胞的廣譜效應(yīng).結(jié)果發(fā)現(xiàn).并不是所有驗證的基因都具有一致的變化情況,提示著在不同細胞類型,IGF

16、BP7會引起不同的下游分子改變.但IGFBP7上調(diào)AREG,P15,ID1,IERSL,IRS1,SOX9,STC1,SYNI,下調(diào)TAGLN在RKO,SW620中均獲得驗證,提示這些基因可能受IGFBP7的表達調(diào)控,有可能是IGFBP7的下游信號分子,對于我們將來深入的研究提供了重要的線索. 雙向凝膠電泳篩選差異表達蛋白顯示:IGFBP7下調(diào)ALB,HSP60.Actin cytoplasmic 1或2,PKM2,FARSB.

17、信息覆蓋量較少.唯有與芯片結(jié)果相互輝映的是:IGFBP7對actin有影響,進一步支持提示IGFBP7可能是個細胞骨架相關(guān)基因. 通過我們以上關(guān)于IGFBP7在結(jié)直腸癌細胞的生物學(xué)功能研究以及效應(yīng)分子初步探索,我們得出以下結(jié)論: 1.IGFBP7對結(jié)直腸癌細胞具有抑制生長、降低軟瓊脂克隆形成能力、誘導(dǎo)凋亡的作用,在結(jié)直腸癌中扮演著抑癌角色. 2.IGFBP7可能是個細胞骨架相關(guān)基因,通過對細胞骨架的重塑也許是IG