三氧化二砷對(duì)小鼠肝臟祖細(xì)胞生物學(xué)特性的影響.pdf

1、目的:
　　探討三氧化二砷(AS2O3)對(duì)小鼠肝臟祖細(xì)胞(adult hepaticprogenitor cells，AHPCs)增殖及代謝的影響。
　　方法:
　　應(yīng)用改良Seglen二步法結(jié)合機(jī)械離心獲取小鼠肝臟祖細(xì)胞，原代培養(yǎng)12天的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別加入含2μM和4μM的AS2O3培養(yǎng)液，不含AS2O3的培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照組。采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)三組細(xì)胞ki-67 mRNA的變化，免疫熒光法觀察三

2、組細(xì)胞ki-67蛋白的表達(dá)，Western-blot技術(shù)檢測(cè)三組細(xì)胞PCNA蛋白的表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)三組細(xì)胞上清液中尿素濃度的變化。
　　結(jié)果:
　　(1) AHPC接種3～4天后活化增殖，7天后可形成明顯的細(xì)胞克隆，10天后進(jìn)入穩(wěn)定增殖期，持續(xù)觀察40天細(xì)胞未丟失增殖活性。AHPC接種后第1天強(qiáng)陽性表達(dá)Albumin，不表達(dá)AFP和CK19。接種后第5天，克隆內(nèi)細(xì)胞開始表達(dá)AFP。接種35天左右，

3、克隆內(nèi)部分細(xì)胞強(qiáng)陽性表達(dá)CK-19，另有部分細(xì)胞強(qiáng)陽性表達(dá)Albumin，少數(shù)細(xì)胞仍強(qiáng)陽性表達(dá)AFP。
　　(2)①陰性對(duì)照組所含ki-67陽性細(xì)胞的比例普遍較高(25.1％±2.8％)，而AS2O3(2μ M)組(18.8％±1.0％)和AS2O3(4μ M)組(11.8％±2.0％)的ki-67陽性細(xì)胞比例逐漸降低。在對(duì)照組與AS2O3(4μ M)組間，以及AS2O3高低濃度組間可見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P值分別為0.005，0.0

4、27），而AS2O3(2μ M)組ki-67陽性細(xì)胞比例在數(shù)值上較對(duì)照組為低，但統(tǒng)計(jì)學(xué)差異并不明顯(P=0.177)。②ki-67 mRNA的表達(dá)量在AS2O3處理組明顯下降，并以AS2O3(4μ M)組降低最為明顯。對(duì)照組與AS2O3(2μ M)組間、對(duì)照組與AS2O3(4μ M)組間以及AS2O3高低濃度組間均存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P值分別為0.005，＜0.001，＜0.001）。而三組間內(nèi)參18s mRNA的表達(dá)并無明顯改變，這一

5、結(jié)果表明AS2O3可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控ki-67的表達(dá)。③Western-blot法比較三組間PCNA蛋白的變化表明隨著AS2O3濃度的增加，PCNA表達(dá)逐漸下降，并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。④Urea濃度隨著AS2O3濃度增加而逐漸下降。對(duì)照組與AS2O3(2μM)組間(0.586±0.056nmol/ul vs0.506±0.058 nmol/ul，p=0.022)、對(duì)照組與AS2O3(4μ M)組間(0.506±0.058 nmol/ul v

6、s0.410±0.045 nmol/ul，p＜0.001)以及AS2O3高低濃度組間0.506±0.058 nmol/ul vs0.410±0.045 nmol/ul，p=0.009）均存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明AS2O3降低了細(xì)胞的代謝能力，并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。
　　結(jié)論:
　　(1)成功的建立了原代小鼠肝臟祖細(xì)胞(AHPC)體外培養(yǎng)模型。
　　(2)體外培養(yǎng)的原代小鼠肝臟祖細(xì)胞(AHPC)具有較強(qiáng)的增殖能力及雙向分化