放射免疫顯像在評價結(jié)直腸癌干細胞標志抗原CD133表達中的初步研究.pdf

1、目的:
　　本研究中檢測了不同結(jié)腸癌細胞系中CD133和CD44兩種標志物的表達情況；在體外研究中分析，不同細胞對131I標記的CD133特異性抗體--AC133.1mAb的攝取差異；并在荷瘤裸鼠體內(nèi)研究標記抗體靶向性識別CD133陽性腫瘤細胞的能力，探索放射免疫顯像在體示蹤腫瘤干細胞的可行性，并為結(jié)直腸癌的放射免疫治療提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.選用三種結(jié)直腸癌細胞系HT29、HCT116和DLD-1，采用流

2、式細胞術(shù)和Western-blot分析檢測其中CD133和CD44分子的表達情況。
　　2.將三種細胞進行Transwell侵襲實驗研究，分析細胞侵襲性與CD133和CD44分子的表達情況之間的相關(guān)性。
　　3.用131I標記CD133分子的特異性單克隆抗體—AC133.1mAb，將標記物使用PD-10脫鹽柱進行純化，并檢測標記抗體的標記率、放化純及穩(wěn)定性。
　　4.對上述三種細胞進行標記抗體131I-AC133mAb

3、體外細胞攝取實驗，分析細胞攝取水平與CD133分子的表達情況間的關(guān)系。
　　5.建立三種細胞的荷瘤裸鼠模型，同時分別設(shè)立實驗組和阻斷組，分別于尾靜脈注射標記抗體，在不同時間點對其進行SPECT/CT斷層顯像及生物學分布實驗，分析標記抗體在體內(nèi)的代謝特點。
　　6.對組織/器官的冰凍切片進行免疫熒光檢測分析和放射自顯影研究，分析體內(nèi)標記抗體的分布與抗原CD133表達情況間的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　1.結(jié)腸癌細胞系H

4、T29、HCT116細胞中CD133分子的表達水平分別為91.33±1.66％、90.83±2.47%，明顯高于DLD-1細胞中CD133分子的表達水平3.87±0.57%（P＜0.01）；而HT29、HCT116和DLD-1細胞中CD44表達水平分別為24.53±8.35%、6.0±0.82%和8.87±3.9%。細胞Western-blot分析結(jié)果顯示：HT29、HCT116細胞高表達CD133，而DLD-1細胞表達量較低；而HT2

5、9細胞中CD44表達較HCT116和DLD-1細胞中CD44表達高。
　　2.三種細胞Transwell實驗結(jié)果顯示，HT29細胞和HCT116細胞穿過的細胞量較多，DLD-1細胞僅有少量明顯細胞穿過。
　　3.標記后的131I-AC133mAb的標記率為68.37±2.45%，純化后，標記抗體的放射性化學純度為91.18±3.41%，且在體外具有較好的穩(wěn)定性。標記抗體的體外細胞攝取研究結(jié)果顯示：HT29和HCT116細胞對

6、131I-AC133mAb的攝取在4h達高峰，分別為29.63±3.92%和33.99±6.65%，其未標記抗體阻斷組的攝取率分別為3.22±0.18%和3.67±0.56%；實驗組與阻斷組間存在顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01)；而DLD-1細胞對131I-AC133mAb的攝取始終較緩慢，在4h時攝取率僅為2.89±0.90%，顯著低于HT29和HCT116細胞4h的攝取率（P＜0.01）。
　　4.從SPECT/CT顯像結(jié)果和生

7、物分布研究結(jié)果來看，荷HT29和HCT116腫瘤鼠在注射131I-AC133mAb后7天的放射性攝取最高，腫瘤組織的克組織百分攝取率分別為5.49±0.42%ID/g和5.04±0.05%ID/g，明顯高于荷DLD-1腫瘤鼠1.20±0.11%ID/g（P＜0.05）；相應(yīng)的腫瘤與肌肉比值（T/M）分別為11.34±0.09，11.31±1.05和3.43±0.53。不同腫瘤組織中標記抗體的放射性分布與免疫熒光分析間保持了較好的一致性。

8、
　　5.在阻斷組實驗中，各時間點腫瘤組織均未見明顯的放射性濃聚，且腫瘤組織的放射性生物分布明顯低于實驗組，注射標記抗體第7天時，荷HT29和HCT116腫瘤鼠的移植瘤阻斷組的生物分布分別為2.18±0.38%ID/g（n=4），2.06±0.35%ID/g（n=4）。
　　6.組織/器官的冰凍切片進行免疫熒光檢測分析和放射自顯影研究顯示：體內(nèi)標記抗體的放射性分布與抗原CD133表達情況相一致。
　　結(jié)論:
　　

9、結(jié)腸癌細胞系HT29和HCT116細胞中CD133表達較DLD-1細胞高，HT29細胞中CD44分子表達水平較HCT116和DLD-1細胞高；體外細胞攝取實驗、SPECT/CT斷層顯像、生物分布和放射自顯影研究都體現(xiàn)了這一差異性，且其中CD133的靶向抗體131I-AC133mAb對該抗原有較好的特異性，顯示出以131I-AC133mAb為分子探針的放射免疫顯像在評價CD133陽性腫瘤細胞的表達水平及分布情況的可行性，為腫瘤干細胞的放射