大鼠視網(wǎng)膜干細(xì)胞生物學(xué)和電生理學(xué)特性研究.pdf

1、視網(wǎng)膜退行性變疾病是嚴(yán)重的致盲眼病，對(duì)于這類疾病目前尚缺乏有效阻止病變進(jìn)展和恢復(fù)視網(wǎng)膜功能的治療方法。視網(wǎng)膜干細(xì)胞移植是新發(fā)展起來(lái)并具有廣闊應(yīng)用前景的治療戰(zhàn)略，其中關(guān)鍵性步驟是提供功能良好的視網(wǎng)膜干細(xì)胞。 就視網(wǎng)膜干細(xì)胞的功能研究方面，目前有許多研究者從形態(tài)學(xué)及神經(jīng)化學(xué)角度證實(shí)了視網(wǎng)膜干細(xì)胞增殖和分化特性，但是有關(guān)視網(wǎng)膜干細(xì)胞電生理學(xué)特性的研究，目前僅有關(guān)于早期和晚期視網(wǎng)膜干細(xì)胞電生理學(xué)特性研究的比較，而關(guān)于從視網(wǎng)膜干細(xì)胞到其分

2、化成成熟神經(jīng)元的過(guò)程缺乏系統(tǒng)的電生理學(xué)研究。采用分子生物學(xué)手段雖然能夠了解每個(gè)細(xì)胞基因的位置和機(jī)能，但是并不能徹底研究神經(jīng)元的電生理特性。眾所周知，神經(jīng)元的基本功能是信號(hào)傳遞，離子和離子通道是產(chǎn)生生物電信號(hào)的基礎(chǔ)，也是細(xì)胞興奮產(chǎn)生動(dòng)作電位的基礎(chǔ)。電信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)整合信息，動(dòng)作電位沿軸突快速傳遞到末梢，形成生物體細(xì)胞間信息傳遞及神經(jīng)元回路構(gòu)建，因此研究視網(wǎng)膜干細(xì)胞不同分化階段神經(jīng)元樣細(xì)胞的離子通道特點(diǎn)，對(duì)了解這些視網(wǎng)膜干細(xì)胞分化后的細(xì)胞能否

3、具備神經(jīng)元的基本功能具有非常重要的意義。膜片鉗技術(shù)是一種以記錄離子通道的電流來(lái)反映細(xì)胞膜上單一的(或多個(gè)的)離子通道分子活動(dòng)的新技術(shù)，從細(xì)胞水平觀察離子通道機(jī)能，且在同一細(xì)胞上可觀察不同通道的活動(dòng)。因此對(duì)視網(wǎng)膜干細(xì)胞的研究如果僅采用分子生物學(xué)手段將具有一定局限性，若能將膜片鉗技術(shù)與形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)等方法相結(jié)合，將有利于將視網(wǎng)膜干細(xì)胞的生物學(xué)特性和電生理特性結(jié)合起來(lái)，為研究視網(wǎng)膜干細(xì)胞提供強(qiáng)有力的理論依據(jù)。 同時(shí)對(duì)視網(wǎng)膜干細(xì)胞向

4、特異性視網(wǎng)膜細(xì)胞分化能力的研究，也是提供功能良好的視網(wǎng)膜干細(xì)胞的關(guān)鍵之一。另外，就視網(wǎng)膜色素變性疾病發(fā)展過(guò)程中是否存在內(nèi)源性視網(wǎng)膜干細(xì)胞進(jìn)行初步探討，為尋求挽救視網(wǎng)膜色素變性患者的視功能新的治療途徑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本研究通過(guò)分離和培養(yǎng)胚胎大鼠視網(wǎng)膜干細(xì)胞，初步探討特定發(fā)育階段的視網(wǎng)膜外液微環(huán)境對(duì)視網(wǎng)膜干細(xì)胞分化的影響，分析視網(wǎng)膜干細(xì)胞不同分化階段細(xì)胞電壓門控離子通道的表達(dá)特點(diǎn)及其變化趨勢(shì)，了解視網(wǎng)膜干細(xì)胞不同分化階段細(xì)胞的電生理

5、學(xué)特性，以期探索視網(wǎng)膜干細(xì)胞功能分化的物質(zhì)基礎(chǔ)。并就視網(wǎng)膜色素變性疾病發(fā)展過(guò)程中是否存在內(nèi)源性視網(wǎng)膜干細(xì)胞進(jìn)行了初步研究。 本研究在上述這些方面做了大量的工作，具體在以下四方面進(jìn)行研究： 第一部分：視網(wǎng)膜干細(xì)胞的培養(yǎng)及凍存 LongEvans胚胎17天大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮來(lái)源的視網(wǎng)膜干細(xì)胞培養(yǎng)、傳代、凍存、復(fù)蘇，并對(duì)復(fù)蘇后的細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)檢測(cè)和能否進(jìn)一步分裂增殖、分化的鑒定，為下面的研究工作做準(zhǔn)備。 本研究

6、成功建立了培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜干細(xì)胞的方法，獲得了可自我擴(kuò)增傳代、性狀穩(wěn)定的視網(wǎng)膜干細(xì)胞，在血清誘導(dǎo)分化條件下可分化為多種表達(dá)視網(wǎng)膜神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物的細(xì)胞。掌握了視網(wǎng)膜干細(xì)胞有效凍存和復(fù)蘇的實(shí)驗(yàn)方法，復(fù)蘇后視網(wǎng)膜干細(xì)胞的存活率約為60-70％，細(xì)胞性狀穩(wěn)定不發(fā)生分化，仍具有自我增殖能力，且可以用血清誘導(dǎo)分化為不同的視網(wǎng)膜細(xì)胞。不同的凍存時(shí)間對(duì)其存活率沒(méi)有影響。 第二部分：細(xì)胞外液微環(huán)境對(duì)視網(wǎng)膜干細(xì)胞影響的研究

7、 1、新生鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞外液微環(huán)境對(duì)視網(wǎng)膜干細(xì)胞特異性誘導(dǎo)分化的影響本部分通過(guò)Transwell共培養(yǎng)裝置分層培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜干細(xì)胞和新生鼠視網(wǎng)膜混合細(xì)胞，同時(shí)以成年階段(30天齡大鼠)的視網(wǎng)膜混合細(xì)胞為對(duì)照，觀察視網(wǎng)膜干細(xì)胞的分化比率變化。由于二者細(xì)胞外液相通，但細(xì)胞不發(fā)生接觸，這樣可以模擬新生和成年時(shí)段時(shí)的視網(wǎng)膜外液微環(huán)境，研究它們對(duì)視網(wǎng)膜干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響。 2、視網(wǎng)膜變性鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞外液微環(huán)境對(duì)視網(wǎng)膜干細(xì)胞的影響將RSC

8、s在Transwell系統(tǒng)中，與RCS大鼠視網(wǎng)膜共培養(yǎng)，在掃描電鏡下觀察變性視網(wǎng)膜組織分泌物對(duì)視網(wǎng)膜干細(xì)胞遷移、分化的影響。 新生大鼠視網(wǎng)膜混合細(xì)胞可能分泌某種物質(zhì)，可以提高視網(wǎng)膜干細(xì)胞向光感受細(xì)胞的分化比率，而成熟大鼠視網(wǎng)膜混合細(xì)胞不具備此功能，可能與該階段細(xì)胞分化信號(hào)途徑的關(guān)閉有關(guān)系；變性視網(wǎng)膜上清液微環(huán)境對(duì)共培養(yǎng)的干細(xì)胞具有趨向誘導(dǎo)作用，并能誘導(dǎo)視網(wǎng)膜干細(xì)胞進(jìn)一步分化，干細(xì)胞受到周圍組織細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)的作用和影響可趨向運(yùn)

9、動(dòng)并誘導(dǎo)分化。 第三部分：視網(wǎng)膜干細(xì)胞不同分化階段細(xì)胞電生理學(xué)特性檢測(cè) 培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜干細(xì)胞，運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)(Whole-cellPatchClamp)分析視網(wǎng)膜干細(xì)胞不同分化階段細(xì)胞電壓門控離子通道的表達(dá)特點(diǎn)及其變化趨勢(shì)，系統(tǒng)和深入地研究大鼠視網(wǎng)膜干細(xì)胞分化不同階段的電生理學(xué)特性，以期探索視網(wǎng)膜干細(xì)胞功能分化的物質(zhì)基礎(chǔ)。同時(shí)將新生鼠視網(wǎng)膜混合細(xì)胞外液誘導(dǎo)視網(wǎng)膜干細(xì)胞分化與10％胎牛血清非特異性誘導(dǎo)分化的細(xì)胞進(jìn)行了

10、電生理學(xué)特性方面的比較研究。在對(duì)視網(wǎng)膜干細(xì)胞分化不同階段的細(xì)胞行膜片鉗全細(xì)胞記錄的同時(shí)，對(duì)不同階段的分化的部分細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)熒光黃(LuciferYellow，LY)標(biāo)記，觀察視網(wǎng)膜干細(xì)胞分化不同階段的細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特性，并將其與分離培養(yǎng)的相應(yīng)時(shí)間段的視網(wǎng)膜神經(jīng)元進(jìn)行比較。目的在于為視網(wǎng)膜干細(xì)胞進(jìn)一步應(yīng)用于細(xì)胞替代治療視網(wǎng)膜變性疾病提供功能水平上的理論依據(jù)。 本研究應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗法成功記錄視網(wǎng)膜干細(xì)胞分化不同階段細(xì)胞上表達(dá)的多種

11、不同電壓門控離子通道，證實(shí)了用全細(xì)胞膜片鉗法進(jìn)行干細(xì)胞分化后離子通道細(xì)胞功能檢測(cè)分析的可行性。采用細(xì)胞內(nèi)注射技術(shù)，能清晰地顯示在普通顯微鏡下不能很好觀察的細(xì)胞形態(tài)，對(duì)于干細(xì)胞的形態(tài)特性及功能分析提供了很好的研究手段。 1、干細(xì)胞分化過(guò)程中逐漸發(fā)育出電壓門控性離子通道，這些通道支持短時(shí)程、反復(fù)性動(dòng)作電位的發(fā)放；視網(wǎng)膜干細(xì)胞與其不同分化階段神經(jīng)樣細(xì)胞擁有不同的電壓門控性電流，從細(xì)胞功能的水平闡述了該視網(wǎng)膜干細(xì)胞及其分化細(xì)胞的標(biāo)志，為

12、今后視網(wǎng)膜干細(xì)胞移植從功能角度提供了理論依據(jù)。 2、大鼠視網(wǎng)膜干細(xì)胞分化過(guò)程中逐漸發(fā)育出電壓門控性離子通道，推測(cè)離子通道的發(fā)育是神經(jīng)元分化過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，這些通道進(jìn)一步分化后可支持動(dòng)作電位發(fā)放，表明離子通道的發(fā)育是視網(wǎng)膜干細(xì)胞分化成具有功能的成熟神經(jīng)元的有效標(biāo)志，為今后視網(wǎng)膜干細(xì)胞研究從功能角度提供了理論依據(jù)。 3、所培養(yǎng)的視網(wǎng)膜干細(xì)胞能分化為功能性神經(jīng)元，可以發(fā)放動(dòng)作電位。今后若能將特異性誘導(dǎo)分化與膜片鉗技術(shù)相結(jié)合，

13、對(duì)特異性誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞進(jìn)行功能檢測(cè)，對(duì)于探討誘導(dǎo)不同類型視網(wǎng)膜神經(jīng)元的調(diào)節(jié)機(jī)制有重要的作用。 4、細(xì)胞不同的電生理學(xué)特性與細(xì)胞不同的形態(tài)構(gòu)筑有一定的相關(guān)性，但尚缺乏一套完整的對(duì)應(yīng)機(jī)制，有待于深入研究，將功能與形態(tài)完美結(jié)合。 第四部分：視網(wǎng)膜色素變性疾病發(fā)展過(guò)程中內(nèi)源性視網(wǎng)膜干細(xì)胞的鑒定 采用RCS大鼠作為先天遺傳性視網(wǎng)膜色素變性疾病模型，初步觀察視網(wǎng)膜色素變性疾病過(guò)程中內(nèi)源性視網(wǎng)膜干細(xì)胞的存在、定位，為尋求挽救

14、視網(wǎng)膜色素變性患者的視功能新的治療途徑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本研究指出，RCS大鼠不同發(fā)育階段均發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性視網(wǎng)膜干細(xì)胞的存在，遺傳性視網(wǎng)膜色素變性可能作為一種慢性刺激因素激活了自身內(nèi)部潛在的視網(wǎng)膜干細(xì)胞。 本研究取得的主要結(jié)論如下： 1、大鼠視網(wǎng)膜干細(xì)胞的凍存復(fù)蘇并不影響其原有的增殖及分化特性，有利于為今后建立“人視網(wǎng)膜干細(xì)胞庫(kù)”提供方法學(xué)基礎(chǔ)。 2、新生大鼠視網(wǎng)膜混合細(xì)胞可能分泌某種物質(zhì)，可以提高視網(wǎng)膜干細(xì)胞

15、向光感受細(xì)胞的分化比率，而成熟大鼠視網(wǎng)膜混合細(xì)胞不具備此功能，可能與特定階段視網(wǎng)膜細(xì)胞外液微環(huán)境中分化信號(hào)的不同有關(guān)系。 3、應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗法成功記錄視網(wǎng)膜干細(xì)胞分化不同階段細(xì)胞上表達(dá)的多種不同電壓門控離子通道，證實(shí)了用全細(xì)胞膜片鉗法進(jìn)行干細(xì)胞分化后離子通道細(xì)胞功能檢測(cè)分析的可行性。采用細(xì)胞內(nèi)注射技術(shù)，能清晰地顯示在普通顯微鏡下不能很好觀察的細(xì)胞形態(tài)。這將不僅有利于今后采用膜片鉗技術(shù)進(jìn)一步深入研究視網(wǎng)膜干細(xì)胞電生理學(xué)特性，而且

16、對(duì)干細(xì)胞的形態(tài)特性及功能分析的結(jié)合研究提供了很好的研究手段。 4、干細(xì)胞分化過(guò)程中逐漸發(fā)育出電壓門控性離子通道，這些通道支持短時(shí)程、反復(fù)性動(dòng)作電位的發(fā)放；視網(wǎng)膜干細(xì)胞與其不同分化階段神經(jīng)樣細(xì)胞擁有不同的電壓門控性電流，闡述了視網(wǎng)膜干細(xì)胞及其分化細(xì)胞在細(xì)胞功能水平的標(biāo)志，為今后視網(wǎng)膜干細(xì)胞移植從功能角度提供了理論依據(jù)。 5、大鼠視網(wǎng)膜干細(xì)胞分化過(guò)程中逐漸發(fā)育出電壓門控性離子通道，離子通道出現(xiàn)的先后順序是鉀通道先表達(dá)，鈉通道

17、后表達(dá)。鈉電流表現(xiàn)為從無(wú)到有，電流峰值即使在同一分化時(shí)間也大小不一。推測(cè)離子通道的發(fā)育是神經(jīng)元分化過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，為今后視網(wǎng)膜干細(xì)胞研究從功能角度提供了理論依據(jù)。 6、細(xì)胞膜的動(dòng)作電位與鈉通道的開放有關(guān)。視網(wǎng)膜干細(xì)胞分化過(guò)程中，當(dāng)鈉通道逐漸發(fā)育成熟產(chǎn)生鈉離子電流后，進(jìn)一步分化方可成為可以發(fā)放動(dòng)作電位的功能性神經(jīng)元，表明離子通道的發(fā)育是視網(wǎng)膜干細(xì)胞分化成具有功能的成熟神經(jīng)元的有效標(biāo)志。 7、本研究對(duì)視網(wǎng)膜干細(xì)胞不同分化階