Bevacizumab對體外培養(yǎng)的豬視網(wǎng)膜色素上皮細胞生物學特性的研究.pdf

1、目的:Bevacizumab進行玻璃體腔內注射治療眼內各種新生血管性疾病,目前已經(jīng)成為眼科領域的新熱點,有關報道(1,2,3)相繼發(fā)表于世,患者的視功能均有不同程度恢復和提高,然而對于其遠期療效,目前各國學者還沒有進行大量的長期隨訪和前瞻性隨機臨床研究。當一種藥物應用于局部,我們應該了解其對靶部位不同組織有無潛在毒性影響,有關Bevacizumab對體外培養(yǎng)的豬視網(wǎng)膜色素上皮細胞生長的影響,國內外臨床和基礎研究較少。本實驗通過體外培養(yǎng)豬

2、RPE細胞來觀察Bevacizumab對視網(wǎng)膜色素上皮細胞的影響。
　　 方法:
　　 1豬視網(wǎng)膜色素上皮細胞培養(yǎng)
　　 1.1摘取豬眼球,去除眼前節(jié)和視網(wǎng)膜神經(jīng)層,用胰酶消化法培養(yǎng)豬原代RPE細胞。
　　 1.2把剝離下來的視網(wǎng)膜神經(jīng)層以1000r/min-1離心5min,加少許培養(yǎng)液,輕吹,吸出上層懸浮的顏色較深的液體,接種于培養(yǎng)瓶中。
　　 1.3細胞鑒定:免疫熒光,透射電鏡兩種方法對RPE

3、細胞進行鑒定。
　　 2 Bevacizumab對體外培養(yǎng)的豬視網(wǎng)膜色素上皮細胞毒性作用
　　 2.1把培養(yǎng)的第3代RPE細胞接種于96孔板中,分別加入終濃度為0,0.125,0.5,1.0,1.25,2.0,2.5mg/ml的Bevacizumab,分別于12h,24h,48h,72h后,MTT比色法測定藥物對RPE增生的影響。
　　 2.2根據(jù)MTT結果,將培養(yǎng)的第3代細胞中加入終濃度為2.0,2.5mg/m

4、l的Bevacizumab,培養(yǎng)72小時后,流式細胞術檢測Bevacizumab對RPE細胞凋亡和細胞周期的影響。
　　 2.3第三代RPE細胞,加入終濃度為2.0mg/ml的bevacizumab作用72h后,透射電鏡觀察RPE細胞形態(tài)的改變。
　　 3 Bevacizumab對豬視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細胞吞噬和移行功能的影響
　　 3.1 ROS制備和FITC熒光標記,細胞色素的制備
　　 室溫下,

5、于暗處用終濃度為10ug/ml的FITC液孵育提取的ROS1小時,然后以細胞培養(yǎng)液調整濃度為1×107/ml。
　　 原代細胞培養(yǎng)時,在第二次換液時,吸取培養(yǎng)瓶下部1/2培養(yǎng)液,用培養(yǎng)液稀釋,-20℃凍存?zhèn)溆谩?br>　　 3.2 RPE細胞的培養(yǎng)及標記
　　 采用胰蛋白酶消化法。把培養(yǎng)的第3代RPE細胞接種于24孔板中,分別加入終濃度為0,0.25,1.0,2.0,2.5mg/ml的Bevacizumab,分別于12

6、h,24h,48h,72h后,用含有終濃度為40ug/mlSR的生長液孵育RPE細胞36小時。
　　 3.3吞噬動力學觀察
　　 向每個培養(yǎng)孔(24孔板)中加入1×107/ml的FITC-ROS50ul,進行孵育24h。將孵育液吸出,以4℃的無血清DMEM沖洗二次,以終止吞噬。在熒光顯微鏡下觀察吞噬量。
　　 3.4非特異性吞噬實驗
　　 采用胰蛋白酶消化法,把培養(yǎng)至無色素的第7代RPE細胞接種于96孔板

7、中,分別加入終濃度為0,0.25,1.0,2.0,2.Smg/ml的Bevacizumab分別于12h,24h,48h,72h后,將培養(yǎng)液吸出,每孔加入含色素的培養(yǎng)液60ul,24h后洗凈,用405nm波長的酶聯(lián)免疫檢測儀檢測RPE吞噬色素量。
　　 3.5檢測對RPE細胞移行能力的影響
　　 將培養(yǎng)的第3代RPE細胞以5×104個每孔接種于24孔細胞培養(yǎng)板上,分別加入終濃度為0,0.25,1.0,2.0,2.5mg/m

8、l的Bevacizumab,分別于12h,24h,48h,72h后,將培養(yǎng)液吸出,制造RPE細胞損傷模型,無血清培養(yǎng)48h,HE染色,計數(shù)進入刮痕區(qū)的細胞數(shù)。
　　 結果:
　　 1.體外培養(yǎng)的豬原代RPE細胞生長良好,有的呈集落式生長,細胞呈不規(guī)則形,接近融合時近六邊形,傳代穩(wěn)定,透射電鏡表明細胞內含大量色素,免疫熒光鑒定抗角蛋白抗原陽性；
　　 2.通過MTT法檢測,2.0-2.5mg/ml濃度范圍內,與對照

9、組比較,Bevacizumab作用72h后RPE細胞生長均有明顯抑制(p<0.05),且呈濃度依賴性；
　　 3.流式細胞術檢測細胞周期和凋亡,Bevacizumab組S期細胞較對照組減少,細胞凋亡與對照組無差異；
　　 4.透射電子顯微鏡觀察細胞的超微結構,Bevacizuman組細胞微絨毛減少,細胞質內出現(xiàn)空泡和髓鞘樣變性；
　　 5.與對照組相比,Bevacizumab的任何濃度和任何時間段對RPE細胞的特

10、異性吞噬和非特異性吞噬都沒有影響；
　　 6.Bevacizumab在2.0-2.5mg/ml濃度范圍內,與對照組比較,Bevacizumab作用48h后可明顯抑制RPE細胞移行。
　　 結論:
　　 1.本研究成功的培養(yǎng)了豬原代RPE細胞,并最大化的收集了RPE細胞,細胞保持正常增殖能力,免疫熒光鑒定抗角蛋白抗原陽性,所采用方法與人RPE細胞培養(yǎng)相近,來源,取材不受限制,操作更方便,可以在某些方面代替人RPE細