人胚眼來源c-kit+-SSEA4-視網(wǎng)膜祖細胞生物學特性的實驗研究.pdf

1、背景：
　　視網(wǎng)膜變性（retinal degeneration，RD）是一組視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細胞或/和光感受器細胞功能異常所引起的視網(wǎng)膜光感受器細胞凋亡的致盲性眼病，無法自身修復，嚴重影響患者生活質量。由于光感受器細胞無法再生，目前尚無有效的治療方法。視網(wǎng)膜變性疾病的治療是國內、外研究的一個熱點問題，目前尚處于探索性研究階段，主要治療方法有基因治療、細胞移植治療、藥物

2、治療、人工視覺假體等。
　　由于變性的光感受器細胞無再生能力，移植健康的視網(wǎng)膜細胞替代或挽救光感受器細胞或視網(wǎng)膜色素上皮細胞，成為最具前景的治療策略之一，也是最有可能實現(xiàn)從基礎研究到臨床轉化的方法。美國先進細胞技術（Advanced Cell Technology, ACT）公司獲得美國食品與藥品管理局（ Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準進行細胞移植治療Stargardt病和干性年齡相關性黃斑

3、變性（Age-related Macular Degeneration，AMD）的Ⅰ/Ⅱ期臨床實驗，研究結果顯示細胞移植后可以改善或維持部分患者的視功能，這對于細胞移植治療視網(wǎng)膜變性疾病具有重要意義。
　　目前治療致盲性眼病常用的眼治療細胞包括來源于胚胎干細胞，間充質干細胞，誘導多能干細胞，胚胎視網(wǎng)膜祖細胞，成體視網(wǎng)膜干細胞等。
　　雖然胚胎干細胞(embryonic stem cells, ESC)是臨床轉化的理想種子細胞

4、之一，但仍存在著致瘤性，免疫排斥等風險，間充質干細胞和誘導多能干細胞存在分化效率低等問題。
　　組織特異性視網(wǎng)膜祖細胞（retinal progenitor cell, RPC）具有一定的增殖、分化能力，安全性較高，是較理想的細胞來源。目前，用于移植的視網(wǎng)膜祖細胞多來源于胚胎視網(wǎng)膜或成體視網(wǎng)膜鋸齒緣處潛在的具有干細胞特征的細胞，該群細胞多未經(jīng)純化，因此移植的細胞內含有多種細胞或處于發(fā)育不同階段的細胞群。
　　隨著流式細胞術的

5、不斷發(fā)展，為分離純化RPC提供了重要的技術手段，但通過流式分選純化細胞，需要應用細胞表面抗原來特異性標記分選細胞，目前對于RPC表面標記物的研究較少，因此找到一種可以純化RPC的表面抗原物，將為RPC的研究提供重要幫助。
　　酪氨酸蛋白激酶受體( tyrosinese Kit or CD117 or c-kit)，是位于細胞膜的識別抗原，具有可進行流式細胞術分選細胞的優(yōu)勢，在造血干細胞、肥大細胞等細胞中表達，對于細胞的生存、增殖和

6、抗凋亡過程中發(fā)揮重要作用。近年研究顯示，c-kit抗原在器官來源的祖細胞中同樣表達，并且該類細胞具有自我更新、形成克隆和多向分化的潛能。肺來源的c-kit+干細胞移植肺損傷模型后可分化為細支氣管，肺泡等結構，并整合到宿主體內修復受損組織，心臟中分離出的c-kit+干細胞，移植后對損傷的心肌組織有修復作用。
　　在小鼠胚眼視網(wǎng)膜中已發(fā)現(xiàn)存在c-kit+視網(wǎng)膜祖細胞，人胚眼視網(wǎng)膜中是否可以分離培養(yǎng)c-kit+視網(wǎng)膜祖細胞尚未見報道，本

7、研究擬應用c-kit作為表面抗原分選培養(yǎng)該群細胞，并對其生物學特性進行鑒定。
　　在小鼠胚胎早期視網(wǎng)膜中存在c-kit與胚胎干細胞標記物階段特異性胚胎表面抗原(stage-specific embryonic antigens, SSEA1)雙陽性細胞，為進一步降低致瘤性的風險，排除胚眼視網(wǎng)膜祖細胞中的胚胎干細胞，本研究中應用階段特異性胚胎表面抗原(stage-specific embryonic antigens, SSEA)作

8、為胚胎干細胞的標記，由于SSEA抗原在人ESC中和鼠ESC中表達不完全一致，人ESC中不表達SSEA1而是表達SSEA4，故本研究擬采用c-kit與SSEA4作為表面標記物，分選c-kit+/SSEA4-人胚眼視網(wǎng)膜來源的RPC，對該群細胞的生物學特性進行鑒定，檢測c-kit+視網(wǎng)膜祖細胞移植至視網(wǎng)膜色素變性動物模型皇家外科學院(Royal college of surgeon, RCS)大鼠視網(wǎng)膜下腔后的存活、遷移、分化情況，以及其對

9、光感受器細胞和視功能的影響，并將c-kit+/SSEA4-視網(wǎng)膜祖細胞移植至嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠皮下進行安全性檢測，以期得到純化的人胚眼來源的視網(wǎng)膜祖細胞，為細胞移植治療或延緩視網(wǎng)膜變性類疾病提供一種理想的種子細胞。
　　第一部分不同胎齡人胚眼中c-kit+/SSEA4-細胞的分布
　　目的：
　　檢測9-16周胎齡人胚眼來源的c-kit+/SSEA4-細胞在眼組織中的分布。
　　方法：
　　人胚胎來源于第

10、三軍醫(yī)大學附屬西南醫(yī)院胚胎組織庫，通過雙頂徑和胎兒足長確定胎齡，設置9-10周組，12-13周組，15-16周組三組，通過對人胚眼冰凍切片行免疫組織化學染色檢測c-kit+/SSEA4-細胞在胚眼視網(wǎng)膜中的分布，利用流式細胞術檢測不同胎齡人胚眼視網(wǎng)膜來源的c-kit+/SSEA4-視網(wǎng)膜祖細胞含量。
　　結果：
　　1．9-16周胎齡胚眼視網(wǎng)膜、脈絡膜中均存在c-kit+/SSEA4-細胞，該群細胞在視網(wǎng)膜多分布于內層，其中

11、周部和周邊部c-kit+/SSEA4-細胞較后極部視網(wǎng)膜分布多；在脈絡膜的后極部及周邊部均呈散在分布。
　　2．胚胎9-10周，12-13周，15-16周視網(wǎng)膜c-kit+/SSEA4-細胞比例分別為2.58±0.35％，4.62±0.60%，4.97±0.99%，9-10周胚胎視網(wǎng)膜c-kit+/SSEA4-細胞比例低于12-13周胚胎視網(wǎng)膜（P<0.05）及15-16周胚胎視網(wǎng)膜（P<0.05），12-13周c-kit+/SS

12、EA4-細胞比例與15-16周胚眼視網(wǎng)膜差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　結論：
　　1．9-10周人胚眼視網(wǎng)膜c-kit+/SSEA4-細胞比例低于12-13周胚眼視網(wǎng)膜及15-16周胚眼視網(wǎng)膜，12-13周c-kit+/SSEA4-細胞比例與15-16周胚眼視網(wǎng)膜差異無統(tǒng)計學意義。
　　2．人胚眼視網(wǎng)膜、脈絡膜中均存在c-kit+/SSEA4-細胞，視網(wǎng)膜內c-kit+/SSEA4-細胞多分布在視網(wǎng)膜內層，中

13、周部和周邊部c-kit+/SSEA4-細胞分布較后極部視網(wǎng)膜多；脈絡膜上腔的c-kit+/SSEA4-細胞呈散在分布。
　　3．確定分離培養(yǎng)9-13周人胚胎中視網(wǎng)膜c-kit+/SSEA4-細胞。
　　第二部分人胚眼c-kit+/SSEA4-視網(wǎng)膜祖細胞增殖分化能力的研究
　　目的：
　　分選培養(yǎng)人胚眼視網(wǎng)膜來源的c-kit+/SSEA4-細胞，并鑒定其增殖，分化能力。
　　方法：
　　通過對視網(wǎng)膜細

14、胞分離、培養(yǎng)和擴增，采用流式細胞術篩選人胚眼視網(wǎng)膜來源的c-kit+/SSEA4-細胞，利用流式細胞術，細胞免疫熒光染色，克隆形成實驗，細胞增殖周期，繪制增殖曲線等方法，檢測c-kit+/SSEA4-細胞的視網(wǎng)膜祖細胞特性，增殖能力以及分化為視網(wǎng)膜終末細胞的潛能。
　　結果：
　　1． c-kit+/SSEA4-視網(wǎng)膜祖細胞分選后在呈貼壁和懸浮培養(yǎng)條件下均可存活，貼壁生長條件下細胞呈單層生長，形態(tài)不規(guī)則，多呈梭型；懸浮培養(yǎng)下

15、以克隆球形式生長。
　　2．c-kit+/SSEA4-視網(wǎng)膜祖細胞表達視網(wǎng)膜祖細胞標記物Pax6(91.6±2.7%), Sox2(95.2±2.0%), Rax(94.1±2.5%),和Nestin(98.9±2.8%)，不表達造血干細胞標記物(CD11b和CD45)和間充質干細胞標記物(CD29和CD140b)。
　　3．c-kit+/SSEA4-視網(wǎng)膜祖細胞具有較強的增殖能力，82.0±3.1%的細胞表達細胞增殖標記物

16、Ki67，細胞周期檢測結果顯示41.13±2.99%的細胞處于分裂增殖期（S期和G2/M期），增殖曲線顯示c-kit+/SSEA4-視網(wǎng)膜祖細胞在貼壁培養(yǎng)條件下培養(yǎng)7天后達到增殖平臺期，細胞可增殖20倍以上。c-kit+/SSEA4-細胞在貼壁和懸浮培養(yǎng)條件下均具有形成克隆的能力。
　　4．在分化培養(yǎng)基誘導下，c-kit+/SSEA4-視網(wǎng)膜祖細胞在分化條件下可表達感光前體細胞特異性標記物Otx2（49.9±4.1%)，Crx(5

17、9.9±4.0%)，光感受器細胞特異性標記物recoverin(68.1±5.1%)，rhodopsin(4.0±0.3%)，節(jié)細胞特異性標記物Thy1(29.1±5.4%）及膠質細胞特異性標記物GFAP（66.7±5.8%）。
　　結論：
　　1． c-kit可作為人胚眼視網(wǎng)膜祖細胞表面標記物，通過流式分選的c-kit+/SSEA4-視網(wǎng)膜祖細胞能傳代培養(yǎng)，并具有視網(wǎng)膜祖細胞特性。
　　2．人胚眼來源的c-kit+/

18、SSEA4-視網(wǎng)膜祖細胞具有自我更新能力，克隆形成能力。
　　3.人胚眼來源的c-kit+/SSEA4-視網(wǎng)膜祖細胞具有分化為光感受器細胞、節(jié)細胞、膠質細胞等視網(wǎng)膜終末細胞的能力。
　　第三部分人胚眼c-kit+/SSEA4-視網(wǎng)膜祖細胞移植治療視網(wǎng)膜變性有效性及安全性的研究
　　目的：
　　觀察c-kit+/SSEA4-視網(wǎng)膜祖細胞移植至RCS大鼠視網(wǎng)膜下腔后的存活、遷移、及分化能力，移植細胞對光感受器細胞和視

19、功能的影響，并進行安全性檢測。
　　方法：
　　應用活細胞染色標記物CM-DiI將分選后的c-kit+/SSEA4-視網(wǎng)膜祖細胞標記，將標記后的c-kit+/SSEA4-視網(wǎng)膜祖細胞移植至出生后3周的RCS大鼠右眼視網(wǎng)膜下腔（n=9），左眼不進行處理，偽手術組（n=9）右眼注射3μl Hanks鹽平衡液，對側眼為空白對照組，不進行任何處理，分別在移植前和移植后4周，8周，12周行視網(wǎng)膜電圖（Electroretinogram

20、，ERG）檢查，并在預定的時間點通過免疫組織化學染色檢測移植細胞的存活、遷移和分化情況，同時測量各組外核層厚度及移植細胞表達光感受器細胞標記物的比例。
　　將12只嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠(severe combined immune deficiency，SCID)分為兩組，實驗組和陽性對照組，分別在腹股溝皮下注射c-kit+細胞和人ESC，觀察12周后，處死小鼠檢測是否成瘤或其他病變。
　　結果：
　　1．c-kit+

21、/SSEA4-視網(wǎng)膜祖細胞在移植后4周，8周和12周少量細胞向視網(wǎng)膜內層遷移，移植細胞主要存在于視網(wǎng)膜下腔，在4周，8周，12周，分別有1.01±0.11%，2.36±0.25%，5.22±0.14%表達光感受器細胞特異性標記物recoverin。
　　2．移植治療組視網(wǎng)膜外核層在4周，8周，12周厚度分別為28.43±1.95μm，23.27±0.85μm，19.43±0.84μm，較偽手術組和空白對照組均增厚(7.67±1.0

22、8μm，8.50±1.47μm)，（6.61±0.65μm,6.83±1.08μm），（4.17±0.75μm,4.80±1.08μm），差異有統(tǒng)計學意義(n=3, P<0.01)。偽手術組和空白對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　3．ERG結果顯示在移植前各組b波波幅差異無統(tǒng)計學意義，在移植后4周和8周，移植治療組b波波幅高于對照組和未處理組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），移植后12周各組b波波幅差異無統(tǒng)計學意義(

23、P>0.05)。
　　4．致瘤性實驗結果顯示實驗組和陽性對照組均未出現(xiàn)免疫排斥反應，實驗組小鼠均未見畸胎瘤形成，陽性對照組出現(xiàn)畸胎瘤，發(fā)生率33.3%。
　　結論：
　　1．c-kit+/SSEA4-人胚眼視網(wǎng)膜祖細胞移植至變性大鼠視網(wǎng)膜下腔后可以存活，具有遷移，分化能力。
　　2．c-kit+/SSEA4-人胚眼視網(wǎng)膜祖細胞對視網(wǎng)膜外核層光感受器細胞具有一定保護作用，可以延緩光感受器細胞凋亡，并改善ERG b波