人胚胎視網(wǎng)膜與視網(wǎng)膜母細胞瘤干細胞生物學特性的比較研究.pdf

1、研究進展顯示，不僅在人類正常組織內(nèi)包括神經(jīng)組織存在干細胞，在人類的腫瘤組織內(nèi)也存在干細胞，這些為人類不可再生性疾病的細胞替代治療及腫瘤發(fā)生發(fā)展機制的闡釋帶來了新的機遇與挑戰(zhàn)。本文選擇人胚胎神經(jīng)視網(wǎng)膜和RB腫瘤為研究對象，試圖揭示人胚胎神經(jīng)視網(wǎng)膜的分化發(fā)育規(guī)律及其視網(wǎng)膜干細胞(retinalstemcell，RSC)的特性；探討RB腫瘤中是否存在腫瘤干細胞(retinoblastomatumorstemcell，RTSC)及其相關特性；初

2、步比較RTSC與RSC的異同。上述研究將為人類視網(wǎng)膜組織工程或再生醫(yī)學研究奠定基礎；為RB的發(fā)生、轉移和復發(fā)機制闡釋提供新的理論依據(jù)；為RB的治療策略選擇提供新靶點，具有重要的理論意義和社會經(jīng)濟效益。 方法 1.實驗材料的收集RB腫瘤組織取自2005年3月～2006年1月期間在中山眼科中心四區(qū)接受手術治療的RB患兒，病理診斷由本中心病理科依據(jù)WHO腫瘤分類作出。不同胚齡人視網(wǎng)膜組織(包括8-12周齡，19周，23周，25

3、周及28周齡，妊娠齡)取自人工合法流產(chǎn)胎兒，健康成人視網(wǎng)膜組織取自本中心角膜移植術后剩余的眼組織。實驗標本的采集依據(jù)中山大學及本中心倫理委員會規(guī)則實施，并征得患者或其家屬知情同意而獲得。 2.人胚胎視網(wǎng)膜形態(tài)學觀察及免疫組化鑒定不同胚齡人眼球，分別用4％PFA固定，冰凍切片，每片6-8um，HE染色，光鏡觀察；部分胚齡視網(wǎng)膜用2％多聚甲醛及2.5％戊二醛固定，透射電鏡觀察。不同胚齡視網(wǎng)膜冰凍切片還進行免疫熒光染色，激光共聚焦顯微

4、鏡觀察。第一抗-有RSC標簽(pax6，nestin，chx10)，7種主要成熟視網(wǎng)膜細胞標簽，包括節(jié)細胞(GAP43/MAP2)，錐細胞(recoverin)，水平細胞(calbindinD-28)，無長突細胞(syntaxin/pax6)，桿細胞(rhodopsin)，膠質(zhì)細胞(GFAP)和雙極細胞(chx10)。以正常成人視網(wǎng)膜(NAR)為對照，以PBS替代一抗為陰性對照。 3.半定量RT-PCR法進行人胚胎視網(wǎng)膜發(fā)育分化

5、基因鑒定TRIZOL法抽提新鮮獲取的不同胚齡視網(wǎng)膜組織總RNA，反轉錄成cDNA，以視網(wǎng)膜發(fā)育分化相關基因為引物進行PCR循環(huán)擴增。所用引物包括RSC相關基因nestin，pax6，RX，chx1O，CD133，Bmi-1；分化細胞標志基因如ARR3(錐細胞)、CNCG(桿細胞)、GFAP(膠質(zhì)細胞)及MAP2/GAP43(神經(jīng)節(jié)細胞)。以人β-actin作為內(nèi)參照，以正常成人視網(wǎng)膜(NAR)為對照。 4.RTSC體外擴增培養(yǎng)新

6、鮮RB組織及細胞系SO-Rb50經(jīng)酶消化法獲取單個瘤細胞，接種于無血清化學限定培養(yǎng)基(SFM)培養(yǎng)，對培養(yǎng)7～15天的神經(jīng)樣腫瘤球體進行傳代培養(yǎng)。倒置顯微鏡下逐日觀察。 5.RTSC的干細胞特性鑒定分別對生長在擴增培養(yǎng)條件及分化培養(yǎng)條件的RTSC進行倒置顯微鏡、電鏡觀察。用克隆球體形成實驗，有限稀釋實驗，BrdU摻入法的分裂增殖實驗及分化實驗等鑒定干細胞的自我再續(xù)及分裂增殖能力和分化能力，將RTSC移植到NOD/SCID小鼠眼內(nèi)

7、觀察成瘤能力。用免疫細胞化學、RT-PCR或流式細胞儀等方法進行RTSC及其分化細胞的特異分子表達鑒定。 6.RTSC生物學特性檢測擴增條件下培養(yǎng)7-14天的RTSC分別進行凍存與復蘇能力，細胞周期，細胞增殖活力、染色體核型分析，神經(jīng)遞質(zhì)(乙酰膽堿、多巴胺及谷氨酸鈉)引起RTSC分化前后細胞內(nèi)鈣離子濃度變化等鑒定。 7.RB腫瘤組織的干細胞鑒定用免疫組織化學方法對本中心病理室2005年6月至2005年11月存檔的RB腫瘤

8、石蠟標本進行干細胞鑒定。第一抗體為pax6,人特異nestin。 結果 1.人胚胎視網(wǎng)膜形態(tài)學及免疫組織化學研究8-9w極早期視網(wǎng)膜未見明顯分層，細胞大部分呈神經(jīng)母細胞/干細胞狀態(tài)，核大，漿少，電鏡下異染色質(zhì)少，細胞器簡單，nestin及pax6陽性細胞彌漫分布，chx1O陽性細胞分布于外神經(jīng)母細胞層，僅后極部出現(xiàn)節(jié)細胞分化，表達GAP43及MAP2。 10-12w早期視網(wǎng)膜已出現(xiàn)ONL，OPL，INL，IPL，

9、GCL等分化層，nestin及pax6陽性的RSC仍彌漫分布在大部分視網(wǎng)膜內(nèi)，可見少量recoverin陽性的錐細胞分化；水平細胞，無長突細胞，桿細胞，膠質(zhì)細胞和雙極細胞的標簽尚無表達。 19w，23w中期視網(wǎng)膜，周邊部仍較幼稚，分化層次少，而后極部已與NAR類似，電鏡下尚未見到外界膜和外節(jié)，nestin及pax6陽性RSC主要位于周邊部視網(wǎng)膜和睫狀體上皮，后極部視網(wǎng)膜已能表達7種成熟視網(wǎng)膜細胞標簽。 25w,28w晚期

10、視網(wǎng)膜，形態(tài)學上后極部和周邊部都與NAR類似，且7種成熟視網(wǎng)膜細胞均已分化，但電鏡檢查仍未見到28w視網(wǎng)膜的外節(jié)。nestin及pax6陽性RSC的定位與NAR類似，主要位于鋸齒緣和睫狀體扁平部上皮。 2.人胚胎視網(wǎng)膜發(fā)育分化基因的半定量RT-PCR檢測RSC相關基因nestin，pax6，RX，chx10等在胚胎視網(wǎng)膜內(nèi)均有強表達，且神經(jīng)干細胞標志基因CD133和分裂增殖基因Bmi-1也呈強表達，但8-12w視網(wǎng)膜無錐細胞(A

11、RR3)、桿細胞(CNCG)及膠質(zhì)細胞(GFAP)基因的表達，僅表達節(jié)細胞分化標簽MAP2，GAP43；19w及22w視網(wǎng)膜對上述分化基因均有表達。 3.RTSC原代及傳代培養(yǎng)RB實體瘤及細胞系SO-Rb50在SFM中可以形成神經(jīng)球體樣腫瘤球體，這種球體可以多次傳代，但SO-Rb50源的RTSC生長速度比實體瘤的快，細胞倍增時間約2～5天。電鏡下這些細胞核大漿少，細胞器間單，異染色質(zhì)少，與8-9w人胚胎視網(wǎng)膜細胞或RSC類似。

12、 4.RTSC干細胞特性鑒定 4.1克隆形成能力及分裂增殖能力分析在每毫升1000個細胞的克隆性接種密度下，或有限稀釋試驗中，RTSC可以連續(xù)性地形成克??；10μmBrdU作用24h后可以摻入到RTSC中，提示具有自我再續(xù)及分裂增殖的能力。有限稀釋實驗也顯示，RB實體瘤細胞中干細胞比率約1.1％，SO-Rb50中約1.4％。 4.2視網(wǎng)膜早期發(fā)育相關分子的表達鑒定免疫熒光顯示RTSC可表達RSC標簽蛋白nestin

13、和pax6。流式細胞儀檢測顯示RB實體瘤細胞中CD133陽性細胞占3.8％，其來源RTSC中CD133陽性細胞占86.3％；RB細胞系SO-Rb50中CD133陽性細胞占10.6％，其來源RTSC中CD133陽性細胞占72.8％，進一步說明SFM可以高效地擴增、富集RTSC。 RT-PCR進一步顯示，實體瘤來源RTSC表達神經(jīng)干細胞或視網(wǎng)膜早期發(fā)育的相關基因Nestin，Pax6，RX，Chx10,CD133及Bmi-1。但不同

14、病人來源的RTSC在nestin，pax6，RX及chx1O的表達程度上強弱不一。尤其是來源SO-Rb50的RTSC不表達RX及chx1O，與對照9w人胚胎視網(wǎng)膜及正常成人視網(wǎng)膜的基因表達有差異。 4.3分化能力分化條件下，RTSC可以向神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞分化，形成視網(wǎng)膜神經(jīng)網(wǎng)絡樣結構，該分化細胞部分表達膠質(zhì)細胞(GFAP)，神經(jīng)元及神經(jīng)節(jié)細胞(MAP2，GAP43)，雙極細胞(PKC-a)，無長突細胞(syntaxin)及錐細胞

15、(recoverin)的蛋白標簽，不表達桿細胞(rhodopsin)及水平細胞(calbindin-D28)標簽。 4.4成瘤能力RB實體瘤來源RTSC與細胞系來源RTSC接種NOD/SCID小鼠眼內(nèi)14天后，發(fā)現(xiàn)兩者在眼內(nèi)均可成瘤。組織學形態(tài)及免疫分子標簽(NSE,MAP2及GFAP)表達上，這些移植瘤與人類RB原發(fā)腫瘤類似。 5.RTSC生物學特性分析RTSC可以在體外凍存，復蘇后仍具有RTSC的特性。細胞周期表現(xiàn)為

16、慢增殖周期。染色體核型分析顯示具有腫瘤性的異常染色體改變。神經(jīng)遞質(zhì)對RTSC分化前后細胞內(nèi)鈣離子濃度變化分析顯示，谷氨酸鈉可引起RTSC分化后細胞內(nèi)鈣離子濃度升高，對分化前細胞無影響，多巴胺及乙酰膽堿對RTSC分化前后細胞均無影響，說明RTSC分化后的神經(jīng)樣細胞主要為谷氨酸能神經(jīng)元細胞。 6.RB腫瘤組織的干細胞鑒定RB腫瘤組織內(nèi)有部分細胞表達pax6和nestin，提示RB腫瘤內(nèi)存在少量視網(wǎng)膜干細胞樣特性的腫瘤干細胞。

17、 結論 1.率先從形態(tài)學及分子水平揭示人神經(jīng)視網(wǎng)膜的胚胎發(fā)生遵循由中央到周邊，由內(nèi)到外的時空發(fā)育規(guī)律。人RSC的分子標簽主要為pax6及nestin；RSC從發(fā)育早期視網(wǎng)膜的彌漫分布，逐漸向發(fā)育晚期的周邊部視網(wǎng)膜、睫狀體上皮遷移。 2.在國內(nèi)外首次用SFM培養(yǎng)擴增的方法揭示RB實體瘤及細胞系SO-Rb50中存在少量具有RSC特性樣的腫瘤干細胞，此類細胞可能是Rb惡性增殖的根源，也將成為Rb治療的新靶點。 3.初步