人胚胎視網(wǎng)膜與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤干細(xì)胞生物學(xué)特性的比較研究.pdf

1、研究進(jìn)展顯示，不僅在人類正常組織內(nèi)包括神經(jīng)組織存在干細(xì)胞，在人類的腫瘤組織內(nèi)也存在干細(xì)胞，這些為人類不可再生性疾病的細(xì)胞替代治療及腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的闡釋帶來(lái)了新的機(jī)遇與挑戰(zhàn)。本文選擇人胚胎神經(jīng)視網(wǎng)膜和RB腫瘤為研究對(duì)象，試圖揭示人胚胎神經(jīng)視網(wǎng)膜的分化發(fā)育規(guī)律及其視網(wǎng)膜干細(xì)胞(retinalstemcell，RSC)的特性；探討RB腫瘤中是否存在腫瘤干細(xì)胞(retinoblastomatumorstemcell，RTSC)及其相關(guān)特性；初

2、步比較RTSC與RSC的異同。上述研究將為人類視網(wǎng)膜組織工程或再生醫(yī)學(xué)研究奠定基礎(chǔ)；為RB的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)機(jī)制闡釋提供新的理論依據(jù)；為RB的治療策略選擇提供新靶點(diǎn)，具有重要的理論意義和社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。 方法 1.實(shí)驗(yàn)材料的收集RB腫瘤組織取自2005年3月～2006年1月期間在中山眼科中心四區(qū)接受手術(shù)治療的RB患兒，病理診斷由本中心病理科依據(jù)WHO腫瘤分類作出。不同胚齡人視網(wǎng)膜組織(包括8-12周齡，19周，23周，25

3、周及28周齡，妊娠齡)取自人工合法流產(chǎn)胎兒，健康成人視網(wǎng)膜組織取自本中心角膜移植術(shù)后剩余的眼組織。實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的采集依據(jù)中山大學(xué)及本中心倫理委員會(huì)規(guī)則實(shí)施，并征得患者或其家屬知情同意而獲得。 2.人胚胎視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)觀察及免疫組化鑒定不同胚齡人眼球，分別用4％PFA固定，冰凍切片，每片6-8um，HE染色，光鏡觀察；部分胚齡視網(wǎng)膜用2％多聚甲醛及2.5％戊二醛固定，透射電鏡觀察。不同胚齡視網(wǎng)膜冰凍切片還進(jìn)行免疫熒光染色，激光共聚焦顯微

4、鏡觀察。第一抗-有RSC標(biāo)簽(pax6，nestin，chx10)，7種主要成熟視網(wǎng)膜細(xì)胞標(biāo)簽，包括節(jié)細(xì)胞(GAP43/MAP2)，錐細(xì)胞(recoverin)，水平細(xì)胞(calbindinD-28)，無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞(syntaxin/pax6)，桿細(xì)胞(rhodopsin)，膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)和雙極細(xì)胞(chx10)。以正常成人視網(wǎng)膜(NAR)為對(duì)照，以PBS替代一抗為陰性對(duì)照。 3.半定量RT-PCR法進(jìn)行人胚胎視網(wǎng)膜發(fā)育分化

5、基因鑒定TRIZOL法抽提新鮮獲取的不同胚齡視網(wǎng)膜組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以視網(wǎng)膜發(fā)育分化相關(guān)基因?yàn)橐镞M(jìn)行PCR循環(huán)擴(kuò)增。所用引物包括RSC相關(guān)基因nestin，pax6，RX，chx1O，CD133，Bmi-1；分化細(xì)胞標(biāo)志基因如ARR3(錐細(xì)胞)、CNCG(桿細(xì)胞)、GFAP(膠質(zhì)細(xì)胞)及MAP2/GAP43(神經(jīng)節(jié)細(xì)胞)。以人β-actin作為內(nèi)參照，以正常成人視網(wǎng)膜(NAR)為對(duì)照。 4.RTSC體外擴(kuò)增培養(yǎng)新

6、鮮RB組織及細(xì)胞系SO-Rb50經(jīng)酶消化法獲取單個(gè)瘤細(xì)胞，接種于無(wú)血清化學(xué)限定培養(yǎng)基(SFM)培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)7～15天的神經(jīng)樣腫瘤球體進(jìn)行傳代培養(yǎng)。倒置顯微鏡下逐日觀察。 5.RTSC的干細(xì)胞特性鑒定分別對(duì)生長(zhǎng)在擴(kuò)增培養(yǎng)條件及分化培養(yǎng)條件的RTSC進(jìn)行倒置顯微鏡、電鏡觀察。用克隆球體形成實(shí)驗(yàn)，有限稀釋實(shí)驗(yàn)，BrdU摻入法的分裂增殖實(shí)驗(yàn)及分化實(shí)驗(yàn)等鑒定干細(xì)胞的自我再續(xù)及分裂增殖能力和分化能力，將RTSC移植到NOD/SCID小鼠眼內(nèi)

7、觀察成瘤能力。用免疫細(xì)胞化學(xué)、RT-PCR或流式細(xì)胞儀等方法進(jìn)行RTSC及其分化細(xì)胞的特異分子表達(dá)鑒定。 6.RTSC生物學(xué)特性檢測(cè)擴(kuò)增條件下培養(yǎng)7-14天的RTSC分別進(jìn)行凍存與復(fù)蘇能力，細(xì)胞周期，細(xì)胞增殖活力、染色體核型分析，神經(jīng)遞質(zhì)(乙酰膽堿、多巴胺及谷氨酸鈉)引起RTSC分化前后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化等鑒定。 7.RB腫瘤組織的干細(xì)胞鑒定用免疫組織化學(xué)方法對(duì)本中心病理室2005年6月至2005年11月存檔的RB腫瘤

8、石蠟標(biāo)本進(jìn)行干細(xì)胞鑒定。第一抗體為pax6,人特異nestin。 結(jié)果 1.人胚胎視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)及免疫組織化學(xué)研究8-9w極早期視網(wǎng)膜未見(jiàn)明顯分層，細(xì)胞大部分呈神經(jīng)母細(xì)胞/干細(xì)胞狀態(tài)，核大，漿少，電鏡下異染色質(zhì)少，細(xì)胞器簡(jiǎn)單，nestin及pax6陽(yáng)性細(xì)胞彌漫分布，chx1O陽(yáng)性細(xì)胞分布于外神經(jīng)母細(xì)胞層，僅后極部出現(xiàn)節(jié)細(xì)胞分化，表達(dá)GAP43及MAP2。 10-12w早期視網(wǎng)膜已出現(xiàn)ONL，OPL，INL，IPL，

9、GCL等分化層，nestin及pax6陽(yáng)性的RSC仍彌漫分布在大部分視網(wǎng)膜內(nèi)，可見(jiàn)少量recoverin陽(yáng)性的錐細(xì)胞分化；水平細(xì)胞，無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞，桿細(xì)胞，膠質(zhì)細(xì)胞和雙極細(xì)胞的標(biāo)簽尚無(wú)表達(dá)。 19w，23w中期視網(wǎng)膜，周邊部仍較幼稚，分化層次少，而后極部已與NAR類似，電鏡下尚未見(jiàn)到外界膜和外節(jié)，nestin及pax6陽(yáng)性RSC主要位于周邊部視網(wǎng)膜和睫狀體上皮，后極部視網(wǎng)膜已能表達(dá)7種成熟視網(wǎng)膜細(xì)胞標(biāo)簽。 25w,28w晚期

10、視網(wǎng)膜，形態(tài)學(xué)上后極部和周邊部都與NAR類似，且7種成熟視網(wǎng)膜細(xì)胞均已分化，但電鏡檢查仍未見(jiàn)到28w視網(wǎng)膜的外節(jié)。nestin及pax6陽(yáng)性RSC的定位與NAR類似，主要位于鋸齒緣和睫狀體扁平部上皮。 2.人胚胎視網(wǎng)膜發(fā)育分化基因的半定量RT-PCR檢測(cè)RSC相關(guān)基因nestin，pax6，RX，chx10等在胚胎視網(wǎng)膜內(nèi)均有強(qiáng)表達(dá)，且神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志基因CD133和分裂增殖基因Bmi-1也呈強(qiáng)表達(dá)，但8-12w視網(wǎng)膜無(wú)錐細(xì)胞(A

11、RR3)、桿細(xì)胞(CNCG)及膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)基因的表達(dá)，僅表達(dá)節(jié)細(xì)胞分化標(biāo)簽MAP2，GAP43；19w及22w視網(wǎng)膜對(duì)上述分化基因均有表達(dá)。 3.RTSC原代及傳代培養(yǎng)RB實(shí)體瘤及細(xì)胞系SO-Rb50在SFM中可以形成神經(jīng)球體樣腫瘤球體，這種球體可以多次傳代，但SO-Rb50源的RTSC生長(zhǎng)速度比實(shí)體瘤的快，細(xì)胞倍增時(shí)間約2～5天。電鏡下這些細(xì)胞核大漿少，細(xì)胞器間單，異染色質(zhì)少，與8-9w人胚胎視網(wǎng)膜細(xì)胞或RSC類似。

12、 4.RTSC干細(xì)胞特性鑒定 4.1克隆形成能力及分裂增殖能力分析在每毫升1000個(gè)細(xì)胞的克隆性接種密度下，或有限稀釋試驗(yàn)中，RTSC可以連續(xù)性地形成克??；10μmBrdU作用24h后可以摻入到RTSC中，提示具有自我再續(xù)及分裂增殖的能力。有限稀釋實(shí)驗(yàn)也顯示，RB實(shí)體瘤細(xì)胞中干細(xì)胞比率約1.1％，SO-Rb50中約1.4％。 4.2視網(wǎng)膜早期發(fā)育相關(guān)分子的表達(dá)鑒定免疫熒光顯示RTSC可表達(dá)RSC標(biāo)簽蛋白nestin

13、和pax6。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示RB實(shí)體瘤細(xì)胞中CD133陽(yáng)性細(xì)胞占3.8％，其來(lái)源RTSC中CD133陽(yáng)性細(xì)胞占86.3％；RB細(xì)胞系SO-Rb50中CD133陽(yáng)性細(xì)胞占10.6％，其來(lái)源RTSC中CD133陽(yáng)性細(xì)胞占72.8％，進(jìn)一步說(shuō)明SFM可以高效地?cái)U(kuò)增、富集RTSC。 RT-PCR進(jìn)一步顯示，實(shí)體瘤來(lái)源RTSC表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞或視網(wǎng)膜早期發(fā)育的相關(guān)基因Nestin，Pax6，RX，Chx10,CD133及Bmi-1。但不同

14、病人來(lái)源的RTSC在nestin，pax6，RX及chx1O的表達(dá)程度上強(qiáng)弱不一。尤其是來(lái)源SO-Rb50的RTSC不表達(dá)RX及chx1O，與對(duì)照9w人胚胎視網(wǎng)膜及正常成人視網(wǎng)膜的基因表達(dá)有差異。 4.3分化能力分化條件下，RTSC可以向神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞分化，形成視網(wǎng)膜神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)，該分化細(xì)胞部分表達(dá)膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)，神經(jīng)元及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(MAP2，GAP43)，雙極細(xì)胞(PKC-a)，無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞(syntaxin)及錐細(xì)胞

15、(recoverin)的蛋白標(biāo)簽，不表達(dá)桿細(xì)胞(rhodopsin)及水平細(xì)胞(calbindin-D28)標(biāo)簽。 4.4成瘤能力RB實(shí)體瘤來(lái)源RTSC與細(xì)胞系來(lái)源RTSC接種NOD/SCID小鼠眼內(nèi)14天后，發(fā)現(xiàn)兩者在眼內(nèi)均可成瘤。組織學(xué)形態(tài)及免疫分子標(biāo)簽(NSE,MAP2及GFAP)表達(dá)上，這些移植瘤與人類RB原發(fā)腫瘤類似。 5.RTSC生物學(xué)特性分析RTSC可以在體外凍存，復(fù)蘇后仍具有RTSC的特性。細(xì)胞周期表現(xiàn)為

16、慢增殖周期。染色體核型分析顯示具有腫瘤性的異常染色體改變。神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)RTSC分化前后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化分析顯示，谷氨酸鈉可引起RTSC分化后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，對(duì)分化前細(xì)胞無(wú)影響，多巴胺及乙酰膽堿對(duì)RTSC分化前后細(xì)胞均無(wú)影響，說(shuō)明RTSC分化后的神經(jīng)樣細(xì)胞主要為谷氨酸能神經(jīng)元細(xì)胞。 6.RB腫瘤組織的干細(xì)胞鑒定RB腫瘤組織內(nèi)有部分細(xì)胞表達(dá)pax6和nestin，提示RB腫瘤內(nèi)存在少量視網(wǎng)膜干細(xì)胞樣特性的腫瘤干細(xì)胞。

17、 結(jié)論 1.率先從形態(tài)學(xué)及分子水平揭示人神經(jīng)視網(wǎng)膜的胚胎發(fā)生遵循由中央到周邊，由內(nèi)到外的時(shí)空發(fā)育規(guī)律。人RSC的分子標(biāo)簽主要為pax6及nestin；RSC從發(fā)育早期視網(wǎng)膜的彌漫分布，逐漸向發(fā)育晚期的周邊部視網(wǎng)膜、睫狀體上皮遷移。 2.在國(guó)內(nèi)外首次用SFM培養(yǎng)擴(kuò)增的方法揭示RB實(shí)體瘤及細(xì)胞系SO-Rb50中存在少量具有RSC特性樣的腫瘤干細(xì)胞，此類細(xì)胞可能是Rb惡性增殖的根源，也將成為Rb治療的新靶點(diǎn)。 3.初步