小鼠胚胎干細(xì)胞來源的Musashi1陽性細(xì)胞的分選及其分化能力的研究.pdf

1、哺乳動(dòng)物腸腔被覆一層黏膜上皮細(xì)胞,這些黏膜上皮細(xì)胞每4-5天更新一次,這種快速更新和腸上皮干細(xì)胞密切相關(guān)。腸上皮干細(xì)胞可分化出各種腸黏膜上皮成熟細(xì)胞。腸上皮干細(xì)胞不僅在腸黏膜上皮的正常新陳代謝中起關(guān)鍵作用,而且也能修復(fù)損傷的腸黏膜上皮。如果腸上皮干細(xì)胞受到不可逆的損害,則腸道損傷黏膜的修復(fù)將變得十分困難,進(jìn)而引起嚴(yán)重的全身系統(tǒng)損傷。嚴(yán)重的腸道黏膜損傷需要干細(xì)胞移植治療才可能修復(fù)。
　　 腸上皮干細(xì)胞具有增殖和自我更新的能力,又可

2、產(chǎn)生各種成熟腸上皮細(xì)胞,因此是治療腸道疾病的理想細(xì)胞。目前沒有獲取腸上皮干細(xì)胞的理想方法,最大的障礙是沒有可靠的腸上皮干細(xì)胞標(biāo)志,無法獲得足夠的腸上皮干細(xì)胞用于研究和治療。研究發(fā)現(xiàn)Musashil是一個(gè)候選的腸上皮干細(xì)胞標(biāo)志基因,對Musashil的研究有利于推動(dòng)腸上皮干細(xì)胞和腸黏膜損傷治療的研究。
　　 Musashil蛋白是一種高度保守的RNA結(jié)合蛋白,是細(xì)胞不對稱分裂的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子,作為一種神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志,在干細(xì)胞的維持、

3、分化和腫瘤形成中扮演重要角色。研究者注意到許多小腸黏膜隱窩表達(dá)Musashil,Musashil陽性細(xì)胞位于潘氏細(xì)胞之上并緊連于潘氏細(xì)胞的幾個(gè)細(xì)胞,Musashil陽性細(xì)胞在腸上皮隱窩的普遍表達(dá)以及合適的表達(dá)數(shù)量都暗示這些Musashil陽性細(xì)胞是腸上皮干細(xì)胞和/或者祖細(xì)胞。腸上皮干細(xì)胞在Musashil基因作用下分裂為兩個(gè)細(xì)胞:一個(gè)細(xì)胞維持干細(xì)胞性質(zhì),停留于腸上皮干細(xì)胞原來的位置,分裂產(chǎn)生的另一個(gè)細(xì)胞作為腸上皮的短暫擴(kuò)增細(xì)胞。這個(gè)短暫

4、擴(kuò)增細(xì)胞離開原來位置,繼續(xù)增殖并逐漸分化,產(chǎn)生潘氏細(xì)胞、吸收上皮細(xì)胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和杯狀細(xì)胞。
　　 最近的研究顯示,小腸黏膜隱窩中的Musashil陽性細(xì)胞不僅僅是存在于潘氏細(xì)胞之上,也存在于潘氏細(xì)胞之間。這些細(xì)胞所處位置就是另一些新出現(xiàn)的候選腸上皮干細(xì)胞標(biāo)志基因,例如leucine-rich repeat-containing G protein-coupledreceptor5(Lgr5)陽性細(xì)胞的出現(xiàn)部位。進(jìn)一步證明M

5、usashil可以作為腸上皮干細(xì)胞,或者至少是祖細(xì)胞的候選基因。Musashil的進(jìn)一步研究受阻于缺少足夠的Musashil陽性細(xì)胞,目前無法從腸黏膜上皮獲取足夠的Musashil陽性細(xì)胞,迫切需要獲取大量Musashil陽性細(xì)胞的方法。小鼠胚胎干細(xì)胞的研究進(jìn)展為獲取大量Musashil陽性細(xì)胞提供了可能。
　　 胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells,ESCs)具有旺盛的增殖擴(kuò)增能力和全能的分化能力,可發(fā)育成機(jī)體

6、所有類型細(xì)胞,在一些嚴(yán)重疾病的治療上有獨(dú)特的優(yōu)勢。經(jīng)過誘導(dǎo)分化或者組織工程處理后,胚胎干細(xì)胞的分化細(xì)胞可以用于治療諸如神經(jīng)變性疾病、糖尿病、心臟病、重癥肝病、燒傷等。目前,已從ESCs誘導(dǎo)出神經(jīng)上皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、血細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞、骨細(xì)胞和胰腺β細(xì)胞等。
　　 PI3K/Akt信號通路對ESCs的自我更新、增殖和分化有重要影響。ESCs的培養(yǎng)基含有多種能激活P13K/Akt信號通路的物質(zhì),在分化過程中研究P

7、I3K/Akt信號通路顯得更為重要。抑制PI3K/Akt信號通路有利于ESCs向中內(nèi)胚層分化,從而可能分化出更多Musashil陽性細(xì)胞。
　　 我們前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在小鼠胚胎干細(xì)胞(mouse ESCs,mESCs)分化過程中有Musashil表達(dá),如果能從mESCs分化細(xì)胞中篩選出Musashil陽性細(xì)胞,無疑將有利于對Musashil基因和腸上皮干細(xì)胞的研究。
　　 研究目的:
　　 本研究在培養(yǎng)mESCs

8、基礎(chǔ)上,在mESCs分化細(xì)胞中檢測Musashil的表達(dá)規(guī)律。構(gòu)建了Musashil啟動(dòng)子報(bào)告基因載體,利用所構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)染mESCs分化細(xì)胞,從中篩選出Musashil陽性細(xì)胞,并對Musashil陽性細(xì)胞的分化能力做了初步研究。觀察抑制mESCs的PI3K/Akt信號通路能否增加mESCs分化過程中Musashil陽性細(xì)胞的數(shù)量。
　　 研究內(nèi)容和方法:
　　 1.采用飼養(yǎng)層和無飼養(yǎng)層兩種方式培養(yǎng)E14tg2a系mE

9、SCs,采用懸滴培養(yǎng)法培養(yǎng)擬胚體。
　　 2.以熒光定量PCR和western blot技術(shù)在mRNA和蛋白兩個(gè)水平檢測E14tg2a細(xì)胞分化過程中Musashil的表達(dá)。
　　 3.提取和鑒定Musashil啟動(dòng)子報(bào)告基因載體pMSI1-GFP。
　　 4.用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù),轉(zhuǎn)染pMSI1-GFP入E14tg2a分化細(xì)胞,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測GFP陽性表達(dá)率。
　　 5.將pMSI1—GFP轉(zhuǎn)染入E14t

10、g2a第11天分化細(xì)胞,以流式細(xì)胞儀分選出Musashil陽性細(xì)胞。
　　 6.將分選出的Musashil陽性細(xì)胞、陰性細(xì)胞和未分選細(xì)胞繼續(xù)體外培養(yǎng),以熒光定量PCR技術(shù)檢測各組第16天分化細(xì)胞的神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志基因(Nestin、TubulinβⅢ)和腸上皮細(xì)胞標(biāo)志的基因(Musashil、Lyz、TFF3)的表達(dá)。
　　 7.將分選出的Musashil陽性細(xì)胞、陰性細(xì)胞和未分選細(xì)胞注射入NOD/SCID小鼠背部皮下,了解

11、移植物的形成能力；以熒光定量PCR技術(shù)檢測各組移植物中的神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志基因(Nestin、TubulinβⅢ)、中胚層標(biāo)志基因(Pax6、PDGFR-α)和腸上皮細(xì)胞標(biāo)志(Villin、FABP2、ChA、Lyz、TFF3)的表達(dá)；以免疫組化技術(shù)檢測Nestin、Villin、FABP2的表達(dá)情況。
　　 8.探討不同濃度LY294002對E14tg2a細(xì)胞增殖的影響。以western blot檢測LY294002對E14tg2a

12、細(xì)胞糖原合成酶激酶(GSK)Ser9磷酸化蛋白的影響。
　　 9.LY294002組和EB組第5天擬胚體分化能力的檢測(GSC、Brachyury、Cxcr4、Sox17、Sox9、TBX6、Sox2)。
　　 10.流式細(xì)胞儀檢測LY294002組和EB組E14tg2a第5天分化細(xì)胞中Cxcr4陽性細(xì)胞比率。
　　 11.檢測LY294002組和EB組E14tg2a第16天分化細(xì)胞的神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志基因(Nesti

13、n、Sox2、TubulinβⅢ)、中胚層標(biāo)志基因(Pax6)和腸上皮細(xì)胞標(biāo)志基因(Musashil、Lgr5、Lyz、TFF3)的表達(dá)。
　　 12.LY294002組和EB組E14tg2a分化細(xì)胞的Musashil表達(dá)及pMSI1-GFP的轉(zhuǎn)染。
　　 13.LY294002組和EB組E14tg2a第10天分化細(xì)胞注射到NOD/SCID小鼠背部皮下形成移植物。以熒光定量PCR技術(shù)檢測移植物中的神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志基因(Nes

14、tin、TubulinβⅢ)、中胚層標(biāo)志基因(Pax6、PDGFR-α)和腸上皮細(xì)胞標(biāo)志基因(Musashil、Villin、FABP2、ChA、Lyz、TFF3、Lgr5)的表達(dá)。以免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測TubulinβⅢ和Villin蛋白的表達(dá)情況。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1.在飼養(yǎng)層和非飼養(yǎng)層上均可順利培養(yǎng)E14tg2a細(xì)胞,細(xì)胞排列呈巢狀,細(xì)胞小而致密。應(yīng)用懸滴培養(yǎng)能順利產(chǎn)生擬胚體,在5x105/ml細(xì)胞濃度下,

15、所形成的胚體大小一致,邊緣光滑。
　　 2.Musashil mRNA在mESCs第11天分化細(xì)胞相對表達(dá)量達(dá)到5.54±0.19,高于其余各組。第10和11天分化細(xì)胞Musashil蛋白wesmrn blot條帶灰度分別是1.56±0.46和1.13±0.25,高于其余組。在Musashil表達(dá)最高峰后,Musashil仍在稍低水平持續(xù)表達(dá)。
　　 3.序列分析顯示所構(gòu)建的質(zhì)粒pMSI1-GFP包含Musashil啟動(dòng)

16、子片段,啟動(dòng)子片段插入在質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)。
　　 4.mESCs和第7、10天分化細(xì)胞轉(zhuǎn)染pMSI1-GFP,24小時(shí)后GFP陽性率分別為0.4±0.06％,0.8±0.05和25.7±6.40％。第10天分化細(xì)胞轉(zhuǎn)染后GFP陽性率最高。
　　 5.GFP陽性細(xì)胞和GFP陰性細(xì)胞的Musashil mRNA相對表達(dá)量分別為15.9±3.40和0.8±0.20；GFP陽性細(xì)胞可檢測到Musashil蛋白表達(dá),GFP陰性細(xì)胞

17、未見Musashil蛋白。GFP陽性細(xì)胞可以認(rèn)為是Musashil陽性細(xì)胞。
　　 6.在貼壁培養(yǎng)條件下,分選出的Musashil陽性和陰性細(xì)胞的神經(jīng)細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞標(biāo)志基因的mRNA表達(dá)沒有顯著性差異。
　　 7.Musashil陽性細(xì)胞組移植物Nestin、TubulinβⅢ、Villin、FABP2、Lyz、TFF3、ChA、Pax6和PDGFR-αmRNA相對表達(dá)量為0.685±0.033,1.800±0.218

18、,1.119±0.209,0.281±0.028,0.0006±0.00004,0.015±0.003,0.038±0.001,0.024±0.009和0.9097±0.139；而Musashil陰性細(xì)胞組移植物相應(yīng)為0.254±0.110,1.056±0.157,0.6275±0.112,0.201±0.005,0.0002±0.0007,0.016±0.003,0.027±0.002,0.117±0.040和1.757±0.254。

19、Musashil陽性細(xì)胞組移植物神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志基因(Nestin、TubulinβⅢ)、腸上皮細(xì)胞標(biāo)志基因(Vitlin、FABP2、Lyz、ChA)mRNA表達(dá)高于Musashil陰性細(xì)胞組移植物,而中胚層標(biāo)志基因(Pax6、PDGFR-α)mRNA表達(dá)低于Musashil陰性細(xì)胞組移植物。
　　 8.相對于Musashil陽性細(xì)胞組,未分選細(xì)胞組和Musashil陰性細(xì)胞組移植物含有更多的軟骨樣組織。
　　 9.未分選

20、細(xì)胞組和Musashil陽性細(xì)胞組移植物的Nestin、Villin和FABP2陽性細(xì)胞表達(dá)多于Musashil陰性細(xì)胞組移植物。
　　 10.western blot條帶灰度比值(GSK-Ser9/GSK)在EB組和5μmol/L濃度LY294002組分別為0.568±0.180和0.015±0.004。5μmol/L濃度LY294002可以抑制E14tg2a細(xì)胞的PI3K/Akt信號通路。5μmol/濃度的LY294002輕

21、度抑制E14tg2a細(xì)胞的增殖。
　　 11.LY294002組第10天分化細(xì)胞Musashil mRNA相對表達(dá)量達(dá)到峰值(4.667±0.234),低于EB組第11天分化細(xì)胞Musashil mRNA相對表達(dá)量(5.540±0.190)。
　　 12.相對于mESCs,EB組第5天擬胚體的GSC、Brachyury、Cxcr4、Sox17、Sox9、TBX6和Sox2 mRNA相對表達(dá)量分別為4.575±0.894,

22、58.127±9.556,5.545±1.002,7.162±1.213,3.785±0.914,0.763±0.138和6.125±1.099；在LY294002組第5天擬胚體則分別為1.258±0.198,37.028±7.331,11.816±2.156,24.114±3.855,9.466±1.116,1.943±0.241和1.378±0.332。EB組、LY294002組分化第5天Cxcr4陽性細(xì)胞比率分別為2.13±0.6

23、5和5.90±1.24。LY294002組第5天分化細(xì)胞的內(nèi)胚層標(biāo)志基因(Cxcr4、Sox17)和中胚層標(biāo)志基因(Sox9、TBX6)表達(dá)高于EB組,而中內(nèi)胚層標(biāo)志基因(GSC、Brachyury)和外胚層標(biāo)志基因(Sox2)表達(dá)低于EB組。
　　 13.相對EB組,LY294002組分化第16天細(xì)胞的Musashil、Lgr5、Nestin、Sox2、Pax6、Lyz、TFF3、TubulinβⅢ的mRNA相對表達(dá)量分別是0

24、.428±0.105,4.832±0.622,0.268±0.035,0.327±0.093,17.500±2.443,2.353±0.246,0.050±0.010和0.126±0.023。EB組細(xì)胞的外胚層標(biāo)志基因(Nestin、Sox2、TubulinβⅢ)的mRNA表達(dá)高于LY294002組,而EB組細(xì)胞的腸上皮細(xì)胞標(biāo)志基因(Lgr5、Lyz)和中胚層標(biāo)志基因(Pax6)的mRNA表達(dá)低于LY294002組。
　　 14

25、.EB組和LY294002組第10天分化細(xì)胞轉(zhuǎn)染pMSI1—GFP后的GFP陽性細(xì)胞率為16.54±2.76和10.04±1.98。LY294002組低于EB組。
　　 15.相對于EB組,LY294002組移植物的Villin、FABP2、Lyz、TFF3、ChA、Musashil、Lgr5、Nestin、TubulinβⅢ、Pax6和PDGFR-α的mRNA相對表達(dá)量為4.422±1.233,4.362±0.897,4.40

26、5±1.004,0.786±0.194,4.877±0.727,0.881±0.217,7.318±1.352,0.336±0.062,0.567±0.105,1.895±0.335和1.893±0.294。LY294002組移植物的腸上皮細(xì)胞標(biāo)志基因(Villin、FABP2、Lyz、ChA、Lgr5)和中胚層標(biāo)志基因(Pax6、PDGFR-α)高于EB組,而神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志基因(Nestin、TubulinβⅢ)低于EB組。
　　

27、 16.LY294002組移植物每個(gè)橫截面含軟骨樣組織7±2.5個(gè),高于EB組移植物(2±1.5個(gè))。
　　 17.LY294002組移植物表達(dá)更多的Villin陽性細(xì)胞和更少的TubulinβⅢ陽性細(xì)胞。
　　 結(jié)論:
　　 1.所構(gòu)建的Musashil啟動(dòng)子報(bào)告載體pMSI1-GFP能追蹤mESCs分化過程中Musashil基因的表達(dá),并能用于從mESCs分化細(xì)胞中分選出Musashil陽性細(xì)胞。