誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化為腸上皮干細(xì)胞及其純化的研究.pdf

1、胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcell，ESC)是一種具有強(qiáng)大的多向分化潛能及自我更新能力的多能干細(xì)胞，其來(lái)源于受精卵細(xì)胞分化后的早期囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，在體內(nèi)或體外可以分化為成體幾乎所有類(lèi)型的組織細(xì)胞，為研究胚胎發(fā)育、細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化、組織器官工程、干細(xì)胞移植治療等多個(gè)學(xué)科領(lǐng)域提供了理想的研究對(duì)象及細(xì)胞來(lái)源。應(yīng)用ESC或其分化后細(xì)胞進(jìn)行移植治療成體器官的結(jié)構(gòu)損傷及功能不全是近年來(lái)ESC研究及應(yīng)用的主要進(jìn)展之一，這一技術(shù)將可能成為未來(lái)

2、臨床上治療某些不可逆性疾病的新選擇。 小腸上皮組織主要由吸收細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞及潘式細(xì)胞構(gòu)成。這4種細(xì)胞均由位于腸隱窩底部的腸上皮干細(xì)胞(intestinalepithelialstemcell，IESC)分化而來(lái)，它們所組成的腸絨毛和隱窩結(jié)構(gòu)是小腸施行吸收、分泌等生理功能的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。正常情況下，IESC自身的增殖與分化維持一定的動(dòng)態(tài)平衡。然而臨床上某些疾病嚴(yán)重干擾了這種快速的自身修復(fù)機(jī)制，導(dǎo)致腸上皮形成難治性損

3、傷，甚至累及至隱窩底部的IESC，使損傷不能修復(fù)，極大影響著患者的生活質(zhì)量，是當(dāng)今臨床治療上一個(gè)棘手的問(wèn)題。 針對(duì)腸黏膜損傷的傳統(tǒng)治療方法，如：小腸移植治療、全胃腸外營(yíng)養(yǎng)及外源性補(bǔ)充細(xì)胞因子促進(jìn)上皮再生等均存在一定的不足。近年來(lái)，一些學(xué)者開(kāi)始探討移植具有腸上皮修復(fù)潛能的細(xì)胞治療難治性小腸損傷，其成果日益受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。然而，IESC作為理想的小腸上皮修復(fù)細(xì)胞由于其來(lái)源受限，一直難以進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究。因此，尋求并建立一

4、種新的用于移植修復(fù)小腸上皮損傷的IESC來(lái)源在推動(dòng)細(xì)胞移植治療腸道損傷方面具有重要意義。 本次研究利用小鼠ESC所具有的三個(gè)胚層分化潛能及表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(epidermalgrowthfactor，EGF)在腸上皮細(xì)胞和IESC分化中的重要作用，在體外使ESC形成胚體(embryonicbody，EB)，確定其中IESC和腸上皮細(xì)胞的前體細(xì)胞群一定型內(nèi)胚層的分化時(shí)間點(diǎn)，并以此階段的EB細(xì)胞作為前體采用EGF進(jìn)行IESC的體外誘

5、導(dǎo)分化，期望利用這一分階段誘導(dǎo)方法確立體外誘導(dǎo)小鼠E14TG2a系ESC定向分化為IESC的條件，并評(píng)價(jià)其體內(nèi)分化及修復(fù)放射性小腸損傷的能力，同時(shí)探索利用微球囊培養(yǎng)法、側(cè)群細(xì)胞分選及構(gòu)建IESC標(biāo)志基因啟動(dòng)子報(bào)告基因載體等方法體外純化IESC的可行性，為IESC體外誘導(dǎo)分化、分離及建立新的移植修復(fù)細(xì)胞來(lái)源提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 研究目的： 本研究以小鼠ESC的多向分化潛能為基礎(chǔ)，探討體外分階段誘導(dǎo)ESC分化為IESC的可行性及條

6、件，為細(xì)胞移植治療小腸上皮損傷及小腸組織器官工程提供細(xì)胞來(lái)源；在獲得含有IESC的細(xì)胞群后，探討通過(guò)側(cè)群細(xì)胞分選、構(gòu)建IESC標(biāo)志基因啟動(dòng)子報(bào)告基因載體及微球囊培養(yǎng)法體外富集IESC的可行性，為體外純化IESC積累實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)。 研究?jī)?nèi)容及方法： 1.以小鼠E14TG2a系ESC作為研究對(duì)象，在體外進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，采用1000u/ml的白血病抑制因子(leukaemiainhibitiryfactor，LIF)抑制其分化；并使

7、用染色體G顯帶技術(shù)明確E14TG2a系ESC的染色體核型，為后續(xù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供依據(jù)；采用懸滴培養(yǎng)法培養(yǎng)EB，使其進(jìn)入三個(gè)胚層的分化階段。 2.以CXCR4、E—cadherin(ECD)、Glypican1(Gpc1)、Transmembrane4superfamily2(Tm4sf2)、goosecoid(Gsc)作為定型內(nèi)胚層的標(biāo)志分子，采用流式細(xì)胞儀及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse—transcriptionpoly

8、merasechainreaction，RT—PCR)監(jiān)測(cè)EB形成過(guò)程中定型內(nèi)胚層的分化情況，并與臟內(nèi)胚層分化鑒別；同時(shí)探討懸滴培養(yǎng)下含50ng/mlActivinA的無(wú)血清培養(yǎng)基在提高定型內(nèi)胚層分化比例中的作用。 3.確定定型內(nèi)胚層分化的時(shí)間點(diǎn)后，在體外采用含40ng/mlEGF的無(wú)血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)推測(cè)的IESC(putativeIESC，PIESC)分化，并以Musashi1(Msi1)及hairyandenhancerofs

9、plit1(Hes1)作為IESC的標(biāo)志分子，采用實(shí)時(shí)定量PCR、Westernblots及免疫細(xì)胞化學(xué)監(jiān)測(cè)及鑒定PIESC分化。 4.種植PIESC及對(duì)照細(xì)胞至NOD/SCID小鼠皮下，培育移植瘤，通過(guò)組織學(xué)和小腸上皮細(xì)胞標(biāo)志分子的免疫組化及RT—PCR分析等方法觀察PIESC在NOD/SCID小鼠體內(nèi)的分化情況，并與對(duì)照組比較，評(píng)價(jià)其小腸上皮的分化能力。 5.利用16Gy的β射線一次性全腹部照射雌性BALB/c小鼠，

10、制作急性放射性小腸損傷模型；通過(guò)設(shè)立照射及治療(RT組)、照射不治療(RNT組)、不照射但治療(NRT組)及不照射不治療(NRNT組)等組別評(píng)價(jià)照射后早期移植PIESC在修復(fù)小腸損傷和提高小腸修復(fù)質(zhì)量中的作用，并利用性別交叉移植的方法，觀察雄性PIESC來(lái)源的供體細(xì)胞在受體小腸、肝、腎中的定植情況。 6.PIESC及其對(duì)照分化細(xì)胞在Hoechst33342染色后進(jìn)行側(cè)群細(xì)胞的測(cè)定及分選，使用實(shí)時(shí)定量PCR及Westernblot

11、s測(cè)定IESC標(biāo)志分子Msi1和Hes1在側(cè)群及非側(cè)群細(xì)胞中的表達(dá)，探討側(cè)群細(xì)胞分選在富集PIESC中的作用。 7.克隆猜測(cè)的Msi1啟動(dòng)子序列，并構(gòu)建Msi1啟動(dòng)子報(bào)告基因載體pMsil—GFP，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染PIESC，分離GFP陽(yáng)性細(xì)胞，利用實(shí)時(shí)定量PCR及Westernblots測(cè)定Msi1和Hes1在GFP+及GFP—組分中的表達(dá)，探討構(gòu)建pMsil—GFP在分離Msi1+Hes1+細(xì)胞(IESC)中的作用。

12、8.使用含40ng/mlEGF的DMEM/F12培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)PIESC，使其中部分細(xì)胞形成微球囊，利用離心法分離微球囊及其余的單個(gè)細(xì)胞，使用實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定兩者中Msi1及Hes1的表達(dá)，評(píng)價(jià)利用這一方法富集Msi1+Hes1+細(xì)胞(IESC)的可行性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.小鼠E14TG2a系ESCs在添加1000u/mlLIF的基礎(chǔ)上，可以在體外擴(kuò)增，形成典型的ESC克隆。此株ESC的染色體核型正常，為(40，XY)

13、，即雄性細(xì)胞。采用懸滴培養(yǎng)法，1×106/ml細(xì)胞密度的ESC可以形成1～1.5mm直徑的EB，進(jìn)入分化狀態(tài)。 2.RT—PCR的分析結(jié)果顯示，定型內(nèi)胚層標(biāo)志基因Gsc、Tm4sf2及Gpc1在5天EB中的表達(dá)相對(duì)輝度分別為0.9809±0.0083、0.9231±0.0097及0.8639±0.0075，顯著高于其它階段的EB(P<0.05)。流式細(xì)胞儀測(cè)定CXCR4+細(xì)胞、ECD+細(xì)胞及CXCR4+ECD+細(xì)胞在第5天EB中

14、的比例分別為34.4±2.87％、29.0±3.21％及6.3±0.18％，顯著高于其它階段的EB(P<0.05)。采用含50ng/mlActivinA因子的無(wú)血清培養(yǎng)基可以使第5天EB中的CXCR4+細(xì)胞比例升高到41.9±3.21％，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。 結(jié)論： 1.采用懸滴培養(yǎng)法，在去除LIF的培養(yǎng)基中ESC可以形成EB，進(jìn)入分化狀態(tài)。 2.懸滴培養(yǎng)5天的EB含有較多的定型內(nèi)胚層細(xì)胞，是進(jìn)行后續(xù)

15、PIESC定向誘導(dǎo)分化的理想前體細(xì)胞群。 3.SF—ActivinA(50ng/ml)培養(yǎng)基可以使懸滴培養(yǎng)5天的EB中所含定型內(nèi)胚層的比例進(jìn)一步升高。 4.通過(guò)5天的SF—EGF(40ng/ml)誘導(dǎo)，5天EB細(xì)胞群可以在體外分化為高度同步表達(dá)Msi1及Hes1的PIESC，其中部分克隆中心部位的細(xì)胞同時(shí)表達(dá)Msi1及Hes1，具有IESC的特征。 5.無(wú)血清的SF—EGF培養(yǎng)基不能長(zhǎng)期維持PIESC中Msi1及

16、Hes1的高表達(dá)。 6.PIESC來(lái)源的移植瘤中大多為腺體樣結(jié)構(gòu)及未定形細(xì)胞，這些組織或細(xì)胞表達(dá)小腸各種上皮細(xì)胞的標(biāo)志分子，證明PIESC具有高度特異的小腸上皮細(xì)胞體內(nèi)分化能力。 7.全腹一次性照射16Gy的β射線可以引發(fā)小鼠的急性放射性腸炎。 8.PIESC移植入放射性小腸損傷小鼠體內(nèi)以后，可以特異的定植于損傷的小腸上皮，并且直接參與小腸上皮的重建，改善上皮組織的修復(fù)質(zhì)量，在損傷小腸的功能及結(jié)構(gòu)恢復(fù)中發(fā)揮重要作

17、用。 9.PIESC中存在側(cè)群細(xì)胞，且更高表達(dá)Msi1及Hes1，利用流式細(xì)胞儀分選側(cè)群細(xì)胞可以在一定程度上起到純化Msi1+Hes1+細(xì)胞的作用。 10.小鼠Msi1基因起始密碼子上游1208bp的序列中含有Msi1特異的啟動(dòng)子序列。 11.構(gòu)建pMsi1-GFP質(zhì)粒載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PIESC后可以利用GFP的表達(dá)標(biāo)記Msi1+細(xì)胞，在此基礎(chǔ)上利用流式細(xì)胞儀分選可以獲得較為純化的Msi1+Hes1+細(xì)胞。